Derivados de coelenterazina y métodos de uso de los mismos.

Un compuesto de fórmula (II):**Fórmula**

en la que R2 es -(CH2)n-T o alquilo C1-5;



R6 se selecciona entre el grupo que consiste en -H, -OH, -NH2, -OC(5 O)R u -OCH2OC(O)R;

R8 se selecciona entre el grupo que consiste en

R11 se selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-RA, -OC(O)O-RA, - N(RB)2 o -NHC(O)ORA;

en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;

RA es alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-RC o -CH2-V-RC;

cada RB es independientemente -H o -RA;

RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido;

L' es un enlazador seleccionado a partir de**Fórmula**

cada RX es independientemente H, halógeno o NO2

cada RY es independientemente H o Me

cada RZ es independientemente NH, NMe, O o S

n es de 0 a 3;

cada R es independientemente un alquilo C1-7;

T es arilo, heteroarilo, arilo sustituido, heteroarilo o cicloalquilo sustituido;

V es -S- u -O-; y

los enlaces de línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2011/058924.

Solicitante: PROMEGA CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: KLAUBERT,DIETER H, MEISENHEIMER,PONCHO, UNCH,JAMES, ZHOU,WENHUI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07D487/04 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07D COMPUESTOS HETEROCICLICOS (Compuestos macromoleculares C08). › C07D 487/00 Compuestos heterocíclicos que contienen átomos de nitrógeno como únicos heteroátomos del ciclo en el sistema condensado, no previstos por los grupos C07D 451/00 - C07D 477/00. › Sistemas condensados en orto.
  • C07H17/02 C07 […] › C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 17/00 Compuestos que contienen radicales heterocíclicos unidos directamente a los heteroátomos de los radicales sacárido. › Radicales heterocíclicos que contienen solamente nitrógeno como heteroátomos del ciclo.
  • C12Q1/66 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una luciferasa.

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Fragmento de la descripción:

Derivados de coelenterazina y métodos de uso de los mismos Esta solicitud reivindica la prioridad del documento de patente de EE.UU. con nº de serie 61/409.413, presentado el 2 de noviembre del 2010.

Campo de la invención La presente invención proporciona compuestos y métodos para someter a ensayo la presencia y la actividad de enzimas.

Antecedentes La presencia y la actividad de enzimas se pueden utilizar para determinar el estado de salud o metabólico de una célula. Las enzimas también pueden ser marcadores de un tipo de célula particular ya que la aparición y la actividad de ciertas enzimas son frecuentemente características de una célula particular. Por ejemplo, la actividad de ciertas enzimas se puede usar frecuentemente para diferenciar células de origen bacteriano, vegetal o animal, o para distinguir la identidad del tejido a partir del cual se produce la enzima.

Las glicosidasas, también conocidas como glucósido hidrolasas, catalizan la hidrólisis del enlace glicosídico para generar dos azúcares más pequeños. Son enzimas muy comunes con funciones en la naturaleza que incluyen la degradación de biomasa, tal como celulosa y hemicelulosa en estrategias de defensa antibacteriana (por ejemplo, lisozima) , en mecanismos de patogénesis (por ejemplo, neuraminidasas víricas) y en la función celular normal (por ejemplo, manosidasas de recorte implicadas en la biosíntesis de glicoproteína ligada a N) . En las bacterias y los procariotas, las glicosidasas se encuentran tanto como enzimas intracelulares como extracelulares que están implicadas en gran medida en la adquisición de nutrientes. Uno de los casos importantes de glicosidasas en bacterias es la enzima beta-galactosidasa (LacZ) , que está implicada en la regulación de la expresión del operón lac en E. coli. En organismos superiores, las glicosidasas se encuentran dentro del retículo endoplasmático y del aparato de Golgi, en donde están involucradas en el procesamiento de glicoproteínas ligadas a N, y en la lisozima como enzimas implicadas en la degradación de estructuras de hidratos de carbono. La carencia de glicosidasas específicas en el lisosoma puede llevar a una serie de trastornos de almacenamiento lisosómico que dan como resultado problemas de desarrollo o la muerte. Las glicosidasas están implicadas en la biosíntesis y la degradación de glucógeno en el organismo. Junto con las glicosiltransferasas, las glicosidasas forman la principal maquinaria catalítica para la síntesis y la rotura de enlaces glicosídicos.

Las diaforasas son una clase ubicua de enzimas unidas a flavina que catalizan la reducción de diversos compuestos, las cuales actúan como aceptoras de hidrógeno, desde la forma reducida de nucleótidos de difosfopiridina y trifosfopiridina, es decir, NADH, NADPH. El metabolismo energético celular es un proceso complejo que permite a las células almacenar energía a través de una serie de reacciones enzimáticas y químicas. Un aspecto esencial del metabolismo energético celular es el estado de oxidación-reducción de la célula. El estado metabólico de las células vivas, así como someter a ensayo la actividad enzimática y/o el nivel de metabolitos, se pueden determinar por la medición del cofactor que define la redox NAD (P) /NAD (P) H.

Compendio En un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I) :

en la que R2 es - (CH2) n-T o alquilo C1-5;

2’ AA

Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC (O) O-R, N (RB) 2 o -NHC (O) ORA; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en -H, -OH, -NH2, -OC (O) R u -OCH2OC (O) R; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en

o cicloalquilo inferior; en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;

A CC

Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R; cada RB es independientemente -H o -RA; RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido; L es un enlazador; n es de 0a 3;

cada R es independientemente un alquilo C1-7; T es arilo, heteroarilo, arilo sustituido, heteroarilo o cicloalquilo sustituido; V es -S-u -O-; y los enlaces de línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado. En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (II) :

en la que R2 es - (CH2) n-T o alquilo C1-5; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en -H, -OH, -NH2, -OC (O) R u -OCH2OC (O) R; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en

o cicloalquilo inferior;

AA

Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC (O) O-R, 5 N (RB) 2 o -NHC (O) ORA;

en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;

A CC

Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R;

cada RB es independientemente -H o -RA; RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido;

L' es un enlazador; n es de 0a 3; cada R es independientemente un alquilo C1-7; T es arilo, heteroarilo, arilo sustituido, heteroarilo o cicloalquilo sustituido; V es -S-u -O-; y

los enlaces de línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (III) :

en donde R6 se selecciona entre el grupo que consiste en -H, -OH, -NH2, -OC (O) R u -OCH2OC (O) R; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en o cicloalquilo inferior;

AA

Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC (O) O-R, 25 N (RB) 2 o -NHC (O) ORA;

en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;

A CC

Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R;

cada RB es independientemente -H o -RA;

RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido; 30 L' es un enlazador;

V es -S-u -O-;

cada X es independientemente -S-, -O-o -NH-; cada R es independientemente alquilo C1-7; y los enlaces de línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado. En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (IV) :

en donde R2 es - (CH2) n-T o alquilo C1-5; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en o cicloalquilo inferior;

AA

Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC (O) O-R, -N (RB) 2 o -NHC (O) ORA;

en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;

A CC

Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R; cada RB es independientemente -H o -RA; RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido; L' es un enlazador; n es de 0a 3;

T es arilo, heteroarilo, arilo sustituido, heteroarilo o cicloalquilo sustituido; V es -S-u -O-; cada X es independientemente -S-, -O-o -NH-; cada R es independientemente alquilo C1-7; y los enlaces con línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado.

La presente invención también proporciona métodos de empleo de los compuestos anteriores.

Breve descripción de los dibujos La FIG. 1 muestra los resultados de pruebas biológicas de z-DEVD-coelenterazina-h. La FIG. 2 muestra los resultados de un ensayo con caspasa 3 empleando una luciferasa obtenida a partir de

Oplophorus y z-DEVD-coelenterazina-h.

La FIG. 3 muestra enlazadores adecuados.

La FIG. 4 muestra coelenterazinas que se pueden derivatizar.

La FIG. 5 muestra ejemplos de sacáridos pro-coelenterazina, útiles en ensayos de glicosidasa.

La FIG. 6 muestra diversos sustratos de peptidilo para las enzimas.

La FIG. 7 muestra pro-coelenterazinas adecuadas para el empleo en ensayos con proteasas.

La FIG. 8 muestra una correlación lineal entre el número de células y la luminiscencia lo que indica una relación directa entre la luminiscencia medida con los compuestos 40 y 50 y el número de células.

La FIG. 9 muestra la detección de NADH usando pro-coelenterazinas de acuerdo con la presente invención.

La FIG. 10 muestra otros sustratos de pro-coelenterazina adecuados de acuerdo con la presente invención.

Descripción detallada La presente invención proporciona compuestos y métodos para someter a ensayo la presencia y la actividad de diversas enzimas en una muestra.

A menos que se especifique expresamente lo contrario, la expresión "que comprende" se utiliza en el contexto de la presente solicitud para indicar que otros miembros pueden estar opcionalmente presentes además... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un compuesto de fórmula (II) :

en la que R2 es - (CH2) n-T o alquilo C1-5; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en -H, -OH, -NH2, -OC (O) R u -OCH2OC (O) R; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en

AA

Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC (O) O-R, N (RB) 2 o -NHC (O) ORA;

en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;

A CC

Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R; cada RB es independientemente -H o -RA; RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido; L' es un enlazador seleccionado a partir de

cada RX es independientemente H, halógeno o NO2

cada RY es independientemente H o Me cada RZ es independientemente NH, NMe, O o S

nesde0a3;

cada R es independientemente un alquilo C1-7;

T es arilo, heteroarilo, arilo sustituido, heteroarilo o cicloalquilo sustituido;

V es -S-u -O-; y

los enlaces de línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado.

2. Un compuesto de fórmula (I) :

en la que R2 es - (CH2) n-T o alquilo C1-5;

2’ AA

Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC (O) O-R, N (RB) 2 o -NHC (O) ORA; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en -H, -OH, -NH2, -OC (O) R u -OCH2OC (O) R; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en

en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;

A CC

Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R; cada RB es independientemente -H o -RA; RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido;

L es un enlazador seleccionado entre cada RX es independientemente H, halógeno o NO2

cada RY es independientemente H o Me cada RZ es independientemente NH, NMe, O o S 15 nesde0a3;

cada R es independientemente un alquilo C1-7;

T es arilo, heteroarilo, arilo sustituido, heteroarilo o cicloalquilo sustituido;

V es -S-u -O-; y

los enlaces de línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado.

3. Un compuesto de fórmula (III) :

en donde R6 se selecciona entre el grupo que consiste en -H, -OH, -NH2, -OC (O) R u -OCH2OC (O) R; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en 12 AA

Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC (O) O-R, N (RB) 2 o -NHC (O) ORA;

en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;

A CC

Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R; cada RB es independientemente -H o -RA;

RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido; L' es un enlazador seleccionado entre

cada RX es independientemente H, halógeno o NO2

cada RY es independientemente H o Me cada RZ es independientemente NH, NMe, O o S

V es -S-u -O-;

cada X es independientemente -S-, -O-o -NH-;

cada R es independientemente alquilo C1-7; y

los enlaces de línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado.

4. Un compuesto de fórmula (IV) :

en donde R2 es - (CH2) n-T o alquilo C1-5; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en

AA

Rse selecciona entre el grupo que consiste en un péptido, un aminoácido, un sacárido, -O-R, -OC (O) O-R, N (RB) 2 o -NHC (O) ORA;

en donde R3 y R4 son ambos H o ambos alquilo C1-2;

A CC

Res alquilo C1-4, alquilo C1-4 sustituido, -CH2-Ro -CH2-V-R; cada RB es independientemente -H o -RA; RC es arilo, heteroarilo, arilo sustituido o heteroarilo sustituido; L' es un enlazador seleccionado entre

cada RX es independientemente H, halógeno o NO2

cada RY es independientemente H o Me cada RZ es independientemente NH, NMe, O o S

n es de0 a 3; 15 T es arilo, heteroarilo, arilo sustituido, heteroarilo o cicloalquilo sustituido;

V es -S-u -O-;

cada X es independientemente -S-, -O-o -NH-;

cada R es independientemente alquilo C1-7; y

los enlaces con línea discontinua indican la presencia de un anillo opcional, que puede estar saturado o insaturado.

5. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4,

en elqueR2 es o alquilo C2-5 de cadena lineal; cada X es independientemente -S-, -O-o -NH-; Z es -CH-o -N-; Y es -H u -OH; W es -NH2, halo, -OH, -NHC (O) R, -CO2R; y R es alquilo C1-7.

6. Un compuesto según la reivindicación 5, en el que Res Xes O o S.

7. Un compuesto según la reivindicación 5, en el que R2 es alquilo C2-5 de cadena lineal.

8. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que R8 es , cicloalquilo inferior o H, en el que R3 y R4 son ambos H o alquilo C1-2.

9. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que R8 es bencilo.

10. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que V es S.

11. Un método para detectar la presencia o la cantidad de una enzima que comprende: poner en contacto una muestra sospechosa de contener la enzima con un compuesto según una cualquiera

de las reivindicaciones 1 a 10; y 20 detectar la luminiscencia de la muestra.

12. El método según la reivindicación 11, en el que la luminiscencia se cuantifica.

13. El método según la reivindicación 11, en el que la muestra es sospechosa de contener una segunda enzima, que comprende

poner en contacto la muestra con un segundo compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 10, en donde el segundo compuesto contiene un sustrato para la segunda enzima; y

detectar la luminiscencia de la muestra.

14. Un método para detectar la presencia de una enzima in vivo que comprende: administrar un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 a un animal transgénico; y detectar la luminiscencia.

15. Un método para detectar la presencia de una enzima que comprende: administrar un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 a un animal; obtener una muestra a partir del animal; y

detectar la luminiscencia de la muestra.

16. Un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste en:


 

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