La expresión aberrante del gen Slug o de sus productos de transcripción o expresión permite detectar la presencia de células cancerosas,

en particular, células tumorales mesenquimales, en una muestra biológica sospechosa de contener dichas células malignas. El gen Slug, o sus productos de transcripción o expresión pueden ser utilizados en el tratamiento del cáncer

Empleo del gen Slug, o de sus productos de transcripción o expresión, en la detección y/o el tratamiento de células cancerosas.

Campo de la invención

La invención se refiere al empleo del gen Slug para detectar la invasividad de células leucémicas positivas con respecto a BCR-ABL en una muestra biológica basado en la expresión aberrante de dicho gen Slug, o de sus productos de transcripción o expresión. La invención también se refiere al empleo del gen Slug, o de sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteínas), en métodos de screening in vitro tal como se define en la reivindicación 11, y a anticuerpos para empleos tal como se definen en las reivindicaciones 12 y 13.

Antecedentes de la invención

Los recientes avances en el tratamiento del cáncer han puesto de manifiesto que para planificar un tratamiento adecuado del cáncer y determinar un pronóstico preciso es necesario disponer de métodos sensibles para detectar la existencia de cáncer, el tipo de cáncer y el estadio del mismo con el fin de conocer su localización concreta y su posible extensión a otros tejidos. Un diagnóstico preciso del cáncer puede contribuir a reducir el número de fallecimientos por esta enfermedad y a mejorar la calidad de vida de los pacientes, ya que permite seleccionar el tratamiento más adecuado (quimioterapia, resección quirúrgica, etc.) y ayuda a reducir las incomodidades al paciente al definir el punto final del tratamiento terapéutico.

Los marcadores de pronóstico proporcionan información importante para el tratamiento y desarrollo del cáncer en los pacientes. De hecho, para la aplicación de terapia sistémica adyuvante en el tratamiento de algunos tipos de cánceres primarios, la identificación de los pacientes de alto y bajo riesgo constituye uno de los hitos principales. Se conocen diversos marcadores de pronóstico, tanto clásicos, tales como el tamaño del tumor, estado del nódulo linfático, histopatología, estado del receptor de esteroides, por ejemplo, como de segunda generación, tales como velocidad de proliferación, ploidía del ADN, oncogenes, receptores de los factores de crecimiento y algunos receptores de glicoproteínas, que resultan muy útiles para tomar decisiones terapéuticas (McGuire, W.L., Pronostic Factors for Recurrence and Survival, en "Educational Booklet American Society of Clinical Oncology", 25^th Annual Meeting, 89-92 (1989); Contesso et al., Eur. J. Clin. Oncol., 25:403-409 (1989)). Aunque ninguno de los marcadores de pronóstico conocidos satisface completamente el objetivo de distinguir entre pacientes de alto y bajo riesgo, la combinación de distintos marcadores puede mejorar la predicción del pronóstico de un paciente, por lo que continúa la búsqueda de nuevos marcadores de pronóstico que puedan añadirse a los existentes actualmente para ayudar en la corroboración del pronóstico del cáncer, de su progresión y de la enfermedad residual tras tratamiento.

Por otra parte, la mayoría de los métodos usados para la detección de células cancerosas tienen una sensibilidad muy limitada, aunque los métodos moleculares basados en el análisis de ácidos nucleicos han mejorado dicha sensibilidad (Burchill S.A. & Selby P.J., J. Pathol. 190:6-14 (2000)). No obstante, ninguna de estas estrategias permite distinguir una célula tumoral invasiva de una célula tumoral no invasiva.

El gen Slug es un gen presente en los vertebrados. Codifica para un factor de transcripción del tipo "dedos de zinc" (SLUG) implicado en las transiciones epiteliales-mesenquimales (Nieto et al., Science 264:835-849 (1994)).

Seidel, M. G. et al. (2000) Onkologie 23:5 notifican que SLUG es una proteína represora transcripcional con dedos de zinc leucemogénica que inhibe la apoptosis en progenitores hematopoyéticos. Inukai et al. (1998) Blood 10 (supl. 1, parte 1-2) página 479A notifican que SLUG es un mediador transcripcional conservado evolutivamente cuya expresión está activada por E2A-HLF, y que en células que expresan la proteína de fusión oncogénica E2A-HLF SLUG contribuye a la leucemogénesis promoviendo la supervivencia de la progenie linfoide del linaje B temprana. Hemavathy, K. et al. (2000) Gene 257:1-12 revisan los hallazgos de que hSlug actúa en el sentido de 3' de E2A-HLF en leucemia inducida por E2A-HLF, y de que mSlug inhibe la apoptosis.

Breve descripción de la invención

La invención se enfrenta, en general, con el problema de encontrar un marcador para la detección de células cancerosas, tales como las células tumorales mesenquimales.

La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han descubierto, sorprendentemente, que la expresión del gen Slug está relacionada con la invasividad de células leucémicas positivas con respecto a BCR-ABL, ya que han podido observar que dichas células malignas expresan niveles significativamente elevados del gen Slug y/o de sus productos de transcripción y expresión cuando se comparan con células normales. Diversos ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que el producto del gen SLUG se expresa en células de muestras de tejidos que presentan células leucémicas invasivas positivas con respecto a BCR-ABL pero no se expresa, o lo hace a niveles prácticamente inapreciables, en muestras de tejidos normales. En una realización particular, los inventores han observado que el gen Slug regula la capacidad diseminativa de las células leucémicas con BCR-ABL, lo que indica que dicho gen Slug juega un papel en la invasión tumoral.

Entre las posibles aplicaciones derivadas del descubrimiento arriba mencionado se incluyen la posibilidad de utilizar el gen Slug, o sus productos de transcripción o expresión, para detectar la invasividad tumoral y/o como diana terapéutica en el tratamiento del cáncer.

Por tanto, un objeto de esta invención lo constituye un método para detectar la invasividad de células leucémicas positivas con respecto a BCR-ABL en una muestra de ensayo basado en la evaluación de la expresión del gen Slug o de sus productos de transcripción o expresión (ARN o proteína).

Un objeto adicional de esta invención lo constituye el empleo del gen Slug o de sus productos de transcripción o expresión, tal como se define en las reivindicaciones 11-13.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 ilustra la regulación positiva del gen Slug por BCR-ABL. La Figura 1A muestra el resultado del análisis de transferencia de Northern de ARN total aislado a partir de células Ba/F3 (banda 1), Ba/F3+p190 (banda 2) y Ba/F3+p210 (banda 3). Se realizaron experimentos de control en células Ba/F3 transfectadas con un vector vacío. La membrana de nylon se hibridó con un fragmento de ADNc de SLUG y después se purificó y rehibridó con una sonda de ß-actina. La Figura 1B muestra el resultado del análisis de transferencia de Northern de ARN total aislado a partir de células Ba/F3+Combip190 desarrolladas en ausencia (banda 1) o presencia de tetraciclina (banda 2), Ba/F3+p190 (banda 2) y células Ba/F3 de control (banda 3). La mancha de transferencia se hibridó con fragmentos de ADNc de SLUG, Bcl-2 y myc, y después se purificó y rehibridó con una sonda de ß-actina.

La Figura 2 muestra la expresión de ARNm de SLUG en tejidos de ratón normal. La Figura 2A muestra el resultado del análisis de transferencia de Northern de ARN total aislado a partir de diversos tejidos de ratón [pulmón, SP (sangre periférica), corazón, testículo, cerebro, intestino, riñón, músculo, hígado, bazo, timo y MO (médula ósea)], hibridado con una sonda de ADNc de Slug y después purificado y rehibridado con una sonda de ß-actina. Se indica la movilidad de los ARN 28S y 18S. (SP, sangre periférica; MO, médula ósea). La Figura 2B ilustra la expresión del ARNm de SLUG en ratones transgénicos BCR-ABLP¹⁹⁰ y BCR-ABLP²¹⁰ y recoge los resultados del análisis de transferencia de Northern de ARN total aislado a partir de sangre periférica de ratones de control (banda 1), y de ratones transgénicos BCR-ABLP¹⁹⁰ (bandas 2 a 4) y ratones transgénicos BCR-ABLP²¹⁰ (bandas 5 a 6), hibridado con una sonda de ADNc y después purificado y rehibridado con una sonda de ß-actina. Se indica la movilidad de los ARN 28S y 18S.

La Figura 3 ilustra que el SLUG endógeno está presente en líneas de células invasivas humanas. Cada molécula de ARN se transcribió mediante retrotranscripción (RT) y los productos...

1. Un método para detectar in vitro la invasividad de células leucémicas positivas con respecto a BCR-ABL en una muestra de ensayo obtenida de un vertebrado sospechoso de tener dichas células leucémicas, basado en la expresión aberrante del gen Slug, que comprende:

en donde la presencia de una expresión aberrante del gen Slug en las células de la muestra de ensayo, cuando se compara con la expresión del gen Slug en las células de la muestra de control, es indicativa de la invasividad de dichas células leucémicas en dicha muestra de ensayo.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho vertebrado es un ser humano.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra de control se selecciona de entre (i) muestras biológicas de vertebrados que no tienen células cancerosas y (ii) muestras biológicas de vertebrados que tienen células cancerosas.

4. Método según la reivindicación 1, en el que la evaluación de la expresión del gen Slug se realiza determinando el número de copias del gen Slug producidas.

5. Método según la reivindicación 4, en el que la determinación del número de copias del gen Slug producidas se realiza visualizando fragmentos dobles extracromosómicos, visualizando regiones de tinción homogéneamente integradas o mediante técnicas de hibridación.

6. Método según la reivindicación 1, en el que la evaluación de la expresión del gen Slug se realiza determinando el nivel de ARNm correspondiente al gen Slug (ARNm de SLUG).

7. Método según la reivindicación 6, en el que la determinación del nivel de ARNm de SLUG se realiza mediante análisis Northern blot, mapeo con la nucleasa S1, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), retro-transcripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), hibridación o microarrays.

8. Un método para detectar in vitro la invasividad de células leucémicas positivas con respecto a BCR-ABL en una muestra de ensayo obtenida de un vertebrado sospechoso de tener dichas células leucémicas, basado en la expresión de la proteína SLUG, que comprende:

en donde la presencia de una expresión aberrante de la proteína SLUG en las células de la muestra de ensayo, cuando se compara con la expresión de la proteína SLUG en las células de la muestra de control, es indicativa de la invasividad de dichas células leucémicas en dicha muestra de ensayo.

9. Método según la reivindicación 8, en el que dicho vertebrado es un ser humano.

10. Método según la reivindicación 8, en el que dicha muestra de control se selecciona de entre (i) muestras biológicas de vertebrados que no tienen células cancerosas y (ii) muestras biológicas de vertebrados que tienen células cancerosas.

11. Un método para el screening in vitro de agentes antitumorales, siendo dichos agentes antitumorales útiles para la modulación de la capacidad invasiva de células leucémicas positivas con respecto a BCR-ABL, basado en la regulación de la expresión del gen Slug, en el que dicho método comprende (i) desarrollar un sistema celular que expresa el gen Slug, (ii) poner en contacto dicho sistema celular con el compuesto a ensayar y (iii) evaluar la expresión del gen Slug, de manera que si no se expresa el gen Slug el compuesto ensayado es un agente antitumoral potencial para la modulación de la capacidad invasiva de células leucémicas.

12. Empleo de un anticuerpo que reconoce a la proteína SLUG, o a un fragmento antigénico de la misma, en la elaboración de un medicamento para la modulación de la capacidad invasiva de células leucémicas positivas con respecto a BCR-ABL.

13. Anticuerpo que reconoce a la proteína SLUG, o un fragmento antigénico de la misma, para su empleo en la modulación terapéutica de la capacidad invasiva de células leucémicas positivas con respecto a BCR-ABL.