PROCEDIMIENTO DE DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES DEL SISTEMA INMUNE.

Procedimiento de diagnóstico de enfermedades del sistema inmune.

La presente invención describe un procedimiento de diagnóstico y pronóstico de una enfermedad que cursa con estimulación del sistema inmune basado en la determinación in vitro del nivel de fosforilación de la DGK{alfa} en el residuo tirosina Y335 en células del sistema inmune, así como un anticuerpo específico de dicha proteína. Además, se describen nucleótidos que inhiben la expresión de dicha proteína y que pueden útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes y de cánceres del sistema inmune

Procedimiento de diagnóstico de enfermedades del sistema inmune.

Campo técnico de la invención

La presente invención se enmarca en el campo de la biomedicina, y más concretamente en la aplicación de herramientas biotecnológicas para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades humanas, y más concretamente de enfermedades con alteración de la respuesta inmune.

Estado de la técnica

Durante la activación de los linfocitos T, en respuesta a la estimulación del receptor de células T (TCR), se producen una serie de eventos ordenados que llevan al desarrollo de la respuesta inmune (Berridge 1997). Dentro de estos eventos juegan un papel primordial las tirosinas quinasas, entre las que destaca p561ck como eje de toda la respuesta desencadenada. La proteína p561ck es una tirosina quinasa de la familia Src que se recluta al TCR tras la estimulación del receptor. En este complejo, p561ck fosforila las moléculas adaptadoras LAT y SPL76 proporcionando sitios de anclaje para otras proteínas como PLC? y ZAP 70. La proteína PLC? hidroliza el fosfatidil inositol (4,5) bi-fosfato (PI(4,5)P₂) y genera dos importantes mensajeros: Inositol tri-fosfato (IP₃), el cual provoca la salida de Ca²⁺ del retículo endoplásmico dando lugar a la activación del factor de transcripción NFAT, y diacilglicerol (DAG), segundo mensajero lipídico involucrado en la activación de la vía PKC/Ras/MAPK, y que da lugar a la activación de los factores de transcripción AP-1 y NFKB. La acción del complejo NFAT-AP1 junto con NFKB permite la expresión de genes necesarios para que se produzca una respuesta inmune correcta. La activación de NFAT en ausencia de activación de AP-1 da lugar a la regulación diferencial de una serie de genes que provocan en las células un estado de no respuesta llamado anergia (Macian, Garcia-Cozar et al. 2002). El mantenimiento de la tolerancia inmunológica de las células T efectoras en la periferia está mediado por la inducción de anergia en aquellas células T que son capaces de reconocer los antígenos propios, es decir, los antígenos generados a partir de proteínas procedentes del propio organismo, evitando con ello procesos auto-inmunes.

El metabolismo del DAG está implicado en los mecanismos de inducción de procesos anérgicos donde se ha descrito la disminución de PLC? (Heissmeyer, Macian et al. 2004) y el aumento de DGKa (Macian, Garcia-Cozar et al. 2002) (Zha, Marks et al. 2006). Este aumento de DGKa provoca una disminución en la localización de RasGRP y con ello se ve disminuida la activación de la ruta Ras/Raf/Erk1-2 (Zha, Marks et al. 2006). Por el contrario, la ausencia de DGKa en un modelo de ratón da lugar a un aumento en la activación de la ruta Ras/Raf/Erk1-2, interfiriendo con ello en los procesos de inducción de anergia (Olenchock, Guo et al. 2006).

El control del DAG producido por la PLC? es esencial para modular la respuesta inmune desencadenada por el TCR. Las diacilglicerolquinasas (DGKs) forman una familia de enzimas que fosforilan el DAG para dar lugar a ácido fosfatídico (PA), modulando el balance entre ambos segundos mensajeros. La familia de las DGKs de mamíferos está compuesta de diez isoformas clasificadas a su vez en cinco subgrupos atendiendo a sus dominios de regulación y de expresión tisular/celular (Sakane and Kanoh 1997; Topham and Prescott 1999; van Blitterswijk and Houssa 2000; Imai, Kai et al. 2005). Todas las DGKs comparten un dominio catalítico muy conservado, dentro del cual destaca la secuencia aminoacídica GGDG. La alteración de esta secuencia da lugar a la pérdida de actividad de la proteína (Sanjuan, Jones et al. 2001). Todas las DGKs presentan al menos dos dominios ricos en cisteína (C1), denominados C1A y C1B según el orden que ocupan dentro de la secuencia de aminoácidos. La función original de los dominios C1 descrita en las PKCs es la de responder al DAG. En el caso de las DGK, los dominios C1 son atípicos, y excepto el C1A de DGKß y ? (Shindo, Irie et al. 2003), el resto de dominios C1 de las DGKs no son capaces de unir DAG. Además, el dominio C1B presenta una extensión de quince aminoácidos que ha servido para postular que su función es la de presentar el DAG al dominio catalítico (van Blitterswijk and Houssa 1999), si bien otros trabajos demuestran que estos dominios son dispensables para la actividad de la DGK (Abe, Lu et al. 2003).

La DGKa pertenece a las DGKs de tipo I (DGKa, ß y ?) que se caracterizan por tener dos dominios de unión a Ca²⁺ (EF-hands) que les permiten responder al incremento de Ca²⁺, siendo la afinidad por el Ca²⁺ dependiente de la isoforma (Yamada, Sakane et al. 1997). La DGKa ejerce diferentes funciones durante la respuesta inmune desencadenada en las células T, por un lado, actúa como regulador negativo de la activación mediada por el TCR de la ruta RasGRP/PKC? (Sanjuan, Jones et al. 2001; Sanjuan, Pradet-Balade et al. 2003) y, por el otro, tiene una función positiva en respuesta al receptor de IL2 (Flores, Casaseca et al. 1996; Flores, Jones et al. 1999), donde el PA generado es necesario para la proliferación. Además, el mecanismo de activación de la DGKa es también diferente en función del receptor. En el caso del TCR, la acción coordinada del Ca²⁺ y de las tirosinas quinasas es la responsable de la localización de la DGKa en la membrana (Sanjuan, Jones et al. 2001). Por el contrario, en respuesta al receptor de IL2, donde no se produce ningún incremento de Ca²⁺, la acción de la PI3K, que da lugar a lípidos fosforilados en la posición 3 del anillo de inositol, es la encargada de modular la función la DGKa (Cipres, Carrasco et al. 2003).

Las tirosinas quinasas juegan un papel fundamental en la activación de la DGKa, no sólo a través de la activación del TCR en el sistema inmune, sino, además, fuera de él, ya que se ha asociado con la respuesta al factor de crecimiento hepático (HGF) (Cutrupi, Baldanzi et al. 2000) y a-D-tocoferol (Fukunaga-Takenaka, Shirai et al. 2005), así como a la actividad tirosina quinasa de la proteína NPM-ALK en ciertos tumores (Bacchiocchi, Baldanzi et al. 2005). Todo ello sugiere que esta mediación puede ser común y necesaria en respuesta a diferentes receptores. Por otro lado, la activación de la DGKa en estos sistemas pone de manifiesto la importancia de la familia de tirosinas quinasas Src en la activación y función de las DGKa, y señala a la tirosina 335 como un aminoácido importante para la movilización de la DGKa desde el citosol a la membrana aunque no se muestran pruebas directas de su acción o que esta translocación se deba únicamente a la acción de la DGKa, siendo además el estímulo distinto de la activación a través de TCR (Fukunaga-Takenaka, Shirai et al. 2005).

Esta tirosina 335 se encuentra en una región muy conservada dentro de la DGKa de todas las especies conocidas, pero no así DGKß o DGK?, lo que sugiere cierta especificidad funcional de la tirosina 335. Por otro lado, la DGKa no es la única isoforma presente en linfocitos T. La DGK?, que se expresa de forma ubicua en numerosos tejidos, se expresa en linfocitos T y B. La DGK?, es una DGK de tipo IV que se caracterizó originalmente como una proteína nuclear (Goto et al. 1996) y que presenta unas características estructurales únicas. Además del dominio catalítico y los dos dominios C1 atípicos, comunes a todas las DGKs, esta proteína posee un dominio tipo MARKS próximo a su dominio de localización nuclear. La regulación por fosforilación de este dominio en la DGK?, regula su localización nuclear, lo que a su vez resulta fundamental en el control de la proliferación celular (Topham M, 1998).

Como se ha comentado anteriormente la DGK? es muy abundante en linfocitos T y la reciente generación de ratones deficientes en esta isoforma ha confirmado su función como un modulador negativo de la respuesta inmune (Zhong, 2003). Los linfocitos T de ratones deficientes en DGK? mostraron una hiperrespuesta a la estimulación y una respuesta inmune mucho más robusta frente a la infección por virus o frente a tumores. El análisis del fenotipo de ratones deficientes para DGKa y ? sugiere la importancia de ambas isoformas en el control de la respuesta inmune (Olenchock BA, Guo R, Carpenter JH, Jordan M, Topham MK, Koretzky GA, Zhong XP. Disruption of diacylglycerol metabolism impairs the induction of T cell anergy. Nat Immunol. 2006 Nov; 7(11):1174-81. Epub 2006 Oct 8).

Sin embargo, estos estudios no permiten evaluar la posible redundancia en...

1. Procedimiento de diagnóstico y pronóstico de una enfermedad en la que se produce la estimulación y proliferación de células T del sistema inmune seleccionada de la lista que consiste en enfermedades autoinmunes, alérgicas, inflamatorias y alteraciones linfoproliferativas caracterizado porque comprende:

a) identificación o determinación del nivel de fosforilación de la proteína DGKa en el residuo tirosina Y335, en una muestra biológica, y

b) comparación de dicha determinación observada en a) con una muestra control, y donde su presencia incrementada es indicativa de la existencia de una enfermedad en la que se produce la estimulación y proliferación de células del sistema inmune.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque la determinación se realiza con un anticuerpo específico frente a la tirosina fosforilada (pY335) de la proteína DGKa de SEQ ID NO2.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

4. Anticuerpo, monoclonal o policlonal y/o recombinante, específico frente a la tirosina fosforilada (pY335) de la proteína DGKa de SEQ ID NO2.

5. Proteína DGKa fosforilada en el residuo tirosina 335 o un fragmento o péptido del mismo, capaz de ser reconocido específicamente por un anticuerpo según la reivindicación 4.

6. Proteína DGKa fosforilada según la reivindicación 5 caracterizada porque es de un mamífero de la lista que consiste en ratón, cerdo, rata y humano.

7. Proteína DGKa fosforilada según la reivindicación 5 caracterizada porque es la proteína humana DGKa fosforilada en la tirosina 335 de SEQ ID NO2.

8. Procedimiento de identificación de compuestos capaces de alterar, activar o inhibir la actividad kinasa de la proteína DGKa mediante la utilización de un anticuerpo según la reivindicación 4.