Dispositivo interfase digital para la integración del modo de imagen en espectroscopio de fuerza monomolecular.

Cuenta con un cabezal de detección de AFM (4) conectado a un controlador de espectroscopia (9) que se une a una tarjeta de obtención de datos (10) instalada en un ordenador (11) unido a un bloque procesador DSP (12) que conecta con un bloque de conversión DAC-ADC (13). La muestra a analizar (1) se monta en un elemento oscilante (2) colocado sobre un posicionador 3D (3) empujado por un motor y unido a un sensor de posición (8) con sensores en tres direcciones. Un controlador de imagen (7) conecta con la tarjeta (10), el bloque de conversión (13), el sensor de posición (8), el posicionador (3), el elemento oscilante (2), el cabezal de detección (4) y el controlador de espectroscopia (9), facilitando el conexionado una caja integradora. El cabezal de detección (4) se ubica en la parte superior de una mesa antivibraciones

Dispositivo interfase digital para la integración del modo de imagen en espectroscopio de fuerza monomolecular.

Objeto de la invención

La presente invención, tal y como se expresa en el enunciado de esta memoria descriptiva, se refiere a un dispositivo interfase digital para la integración del modo de imagen en la espectroscopia de fuerza monomolecular, cuya finalidad esencial consiste en proporcionar una herramienta sencilla, fiable, estable y de fácil implementación con la característica novedosa de añadir capacidades de formación de imágenes a un procedimiento standard muy usado en nanomecánica de proteínas. Dicha herramienta o instrumento se consigue básicamente mediante la interconexión de un controlador de imagen y otros bloques funcionales electrónicos a un microscopio de fuerza atómica (AFM, de sus siglas en inglés) y con determinados programas informáticos. El instrumento resultante combina las potentes capacidades de la última generación de dispositivos de espectroscopia de fuerza con toda la variedad de modos de formación de imágenes disponibles: por contacto, dinámico y por saltos. Usando un sistema modelo de poliproteínas (dominio I27 de la titina) se demuestra la capacidad de formación de imágenes, nanoposicionamiento y medición de fuerza casi simultáneas del dispositivo de la invención.

En la mayoría de estudios sobre nanomecánica de proteínas (medición de sus propiedades mecánicas a escala atómica) se utiliza el microscopio de fuerza atómica (AFM) en su modalidad de medición de fuerzas, es decir actuando como espectroscopio de fuerzas. Mediante la presente invención se añade la capacidad de formación de imágenes al dispositivo AFM en su modalidad de espectroscopio de fuerza y se integran programas de análisis potentes y disponibles para ambas modalidades. Mediante el dispositivo de la invención, único en su género es posible lograr un análisis de espectroscopia de fuerza y la formación de imágenes para moléculas individuales de manera casi simultánea y con una alta resolución.

Además, mediante la herramienta proporcionada por el dispositivo de la invención se pretende facilitar el desarrollo de un sistema de funcionalización universal muy necesario para permitir un mejor control de la muestra y una eficacia mejorada de inmovilización de proteínas necesaria para realizar los análisis con AFM.

Antecedentes de la invención

El microscopio de fuerza atómica (AFM) es un aparato que permite medir propiedades mecánicas de los materiales con resolución atómica [1]. La principal aplicación de este instrumento en biología ha sido la formación de imágenes superficiales a alta resolución de estructuras biológicas en su entorno acuoso natural [2]. Además, de esto se puede obtener información mecánica importante de la muestra usando el AFM en la denominada configuración de espectroscopia de fuerza [3].

El fundamento básico del AFM es la medición de la deflexión de un fleje a través de un láser reflejado en la superficie de este fleje a la vez que se desplaza la muestra a analizar en las tres direcciones del espacio (gracias a la actuación de un posicionador piezo-eléctrico) para lograr así la interacción de la punta fina del fleje con la muestra en las tres dimensiones. La deflexión de este fleje o sensor se detecta a través de la medida en el voltaje de un fotodiodo dual, de manera que cuando el fleje está en equilibrio la cantidad de luz sobre las dos partes del fotodiodo es la misma y la fuerza (diferencia de voltaje generador en cada sector del fotodiodo) será O. La interacción de la punta del fleje con la superficie de la molécula hace que el mismo se flexiona, provocando que el fotodiodo detecte más luz en un sector que en otro. De esta manera se obtiene una señal en voltaje que está relacionada con la fuerza ejercida en la punta por la muestra bajo estudio. Otra parte básica de un microscopio de fuerzas es la señal de alto voltaje enviada a un posicionador piezo-eléctrico para mover la muestra bajo la punta y poder escanear la superficie. Por su parte, en un microscopio de fuerzas convencional la unidad generadora de alto voltaje que envía las señales al posicionador piezo-eléctrico y el controlador de dicho posicionador pueden encontrarse integrados en un mismo bloque o no. Así, por ejemplo el sistema de control Dulcinea (Nanotec Electrónica, S.L.) integra ambos elementos, mientras el sistema inicial desde el que se ha desarrollado la presente invención [7], mantenía ambos elementos separados, en este caso una controladora JRC Instruments y un amplificador de alto voltaje de Physik Instruments. El último componente básico es un ordenador provisto de tarjetas de adquisición de datos y de un software específico para procesar digitalmente las señales de la fuerza normal (la proveniente del fotodiodo) y las rampas que van al amplificador y después al piezoeléctrico. Este procesado permite representar los datos en bruto (espectro de fuerzas) o visualizar la topografía de la muestra como una imagen.

Puesto que el AFM estaba originalmente diseñado para registrar curvas de fuerza-extensión incluye un único posicionador piezoeléctrico, por lo que la tecnología más avanzada en el campo de los "espectrómetros de fuerza" se basa en el diseño "por encargo" de AFMs especializados en la extensión de las moléculas en una única dimensión, lo que permite su análisis individual [4].

En esta denominada modalidad de espectroscopia de fuerza de moléculas individuales (SMFS, de sus siglas en inglés), el AFM es capaz de medir fuerzas con una sensibilidad de decenas de piconewtons y cambios de longitud en las moléculas con resolución nanométrica, en una escala de tiempo en el rango de milisegundos. Estos instrumentos han permitido el análisis de eventos de despliegue y repliegue de moléculas individuales en proteínas modulares [5] y, con el uso de poliproteínas recombinantes (que permiten una identificación clara de moléculas individuales), en módulos proteicos individuales [6] así como en proteínas no modulares. Por consiguiente, la aplicación de la SMFS al estudio de las proteínas se ha extendido rápidamente de manera que ha surgido un nuevo campo de investigación, denominado "nanomecánica de proteínas". Es evidente sin embargo que estos avances también tienen potencial en el análisis de moléculas no proteicas, por lo que podríamos hablar de nanomecánica molecular.

Tras sus primeras aplicaciones al estudio de las proteínas [5, 6] la SMFS ha evolucionado gracias a una segunda generación de instrumentos que incorpora un posicionador 3D compacto con resolución subnanométrica (aproximadamente 0,5 nm), el modo de fuerza constante y un potente software, permitiendo funcionalidades tales como el funcionamiento semiautomático, el reconocimiento automático de patrones periódicos de poliproteínas y el establecimiento de protocolos específicos para despliegue y repliegue de proteínas. Estas características y funciones se han integrado actualmente mediante un paquete de software específico basado en IGRO Pro, que es de acceso público [7]. Si bien no existe propiamente un dispositivo para SMFS con estas características en el mercado, si lo están todos sus compo-nentes, de manera que diversos grupos ya han establecido esta configuración de manera satisfactoria [8, 9, 10, 11].

Actualmente los análisis de tipo SMFS deben afrontar tres importantes restricciones: la falta de conocimiento del estado inicial de la muestra antes del experimento, la aleatoriedad en la "recogida" o selección de moléculas para cada observación y el que esta "recogida" tenga una eficacia reducida, pues a menudo no es posible seleccionar moléculas individuales. Asimismo, debe tomarse en consideración que, tras la inmovilización sobre una superficie, necesaria para su análisis mediante el AFM, las moléculas biológicas, y en particular las proteínas pueden desnaturalizarse en cierto grado [12]. Por lo tanto, en un experimento de SMFS normal, la muestra (generalmente una proteína purificada por cromatografía de afinidad) puede estar constituida por una población heterogénea de especies moleculares, que incluye moléculas individuales (nativas, parcialmente desnaturalizadas, completamente desnaturalizadas y plegadas incorrectamente), complejos supramoleculares, agregados y moléculas contaminantes. Si bien el uso de poliproteínas (en las que una única molécula proteica incluye diversas proteínas con funcionalidades individuales) es muy útil para realizar análisis de módulos proteicos individuales e inferir la identificación de moléculas individuales, su uso no siempre puede excluir todas estas posibles fuentes de error.