DETECCION Y CUANTIFICACION DE IMINAS CICLICAS BASADA EN LA UNION COMPETITIVA A RECEPTORES NITOTINICOS DE ACETILCOLINA.
Procedimiento de cuantificación de iminas cíclicas basado en la unión competitiva a receptores nicotínicos de acetilcolina.
Las iminas cíclicas gymnodiminas y espirólidos pueden aparecer como contaminantes en moluscos marinos destinados al consumo humano. Se ha utilizado la capacidad de estas iminas cíclicas de unirse a los receptores nicotínicos de acetilcolina de forma competitiva con la a-bungarotoxina para desarrollar un método de detección de estas toxinas en solución. La invención se basa en la cuantificación de la unión de los receptores nicotínicos a la a-bungarotoxina utilizando técnicas que detectan interacciones moleculares, como la medición de los cambios de polarización de fluorescencia o la monitorización de cambios del índice de refracción en las proximidades de una superficie. Esta señal de unión de a-bungarotoxina al receptor se inhibe por la presencia de iminas cíclicas en solución permitiendo la cuantificación de estas toxinas marinas mediante una calibración previa
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200800608.
Solicitante: UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: A CORUÑA.
Inventor/es: BOTANA LOPEZ,LUIS MIGUEL, MOLGO, JORDI, VILARIO DEL RIO,NATALIA, FONFRIA SUBIROS,EVA, ARAOZ,ROMULO.
Fecha de Solicitud: 21 de Febrero de 2008.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 26 de Febrero de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07C251/02 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07C COMPUESTOS ACICLICOS O CARBOCICLICOS (compuestos macromoleculares C08; producción de compuestos orgánicos por electrolisiso electroforesis C25B 3/00, C25B 7/00). › C07C 251/00 Compuestos que contienen átomos de nitrógeno, unidos por enlaces dobles a una estructura carbonada (compuestos diazo C07C 245/12). › que contienen grupos imino.
- C07K14/705 C07 […] › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie.
- G01N33/50 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
Clasificación PCT:
- C07C251/02 C07C 251/00 […] › que contienen grupos imino.
- C07K14/705 C07K 14/00 […] › Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie.
- G01N33/50 G01N 33/00 […] › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
Fragmento de la descripción:
Detección y cuantificación de iminas cíclicas basada en la unión competitiva a receptores nicotínicos de acetilcolina.
Sector de la técnica
Detección y cuantificación de toxinas.
Antecedentes de la invención
Gymnodiminas y espirólidos fueron descubiertos en la primera mitad de los años 90 (flu, T., et al. 2001. J Nat Prod, 64, 308-12; Molgó, J., et al. 2007. Phycotoxins. Chemistry and Biochemistry., Botana, L.M., 319-335; Seki, T., et al. 1995. Tetrahedron Left, 36, 7093-7096). Son toxinas producidas por especies planctónicas que se acumulan en el cuerpo de los mariscos filtradores que se alimentan de ellas. Como consecuencia, estas toxinas llegan al hombre por el consumo de moluscos contaminados. La presencia de las iminas cíclicas gymnodimina y espirólidos en mariscos se puede detectar en la actualidad mediante dos técnicas. La primera de ellas, denominada técnica de bioensayo en ratón, consiste en la inyección intraperitoneal a ratones de un cierto peso de un extracto de la vianda (Munday, R., et al. 2004. Toxicon, 44, 173-8; Richard, D., et al. 2000. Harmful Algal Blooms, 383; Yasumoto, T., et al. 1978. Bulletin of Japanese Society of Science and Fisheries, 44, 1249-1255). Esta técnica, además de problemas éticos por requerir el sacrificio de gran número de animales, presenta problemas técnicos como el gran número de falsos positivos y la falta de selectividad para los distintos grupos de toxinas. Esta falta de selectividad del biosensayo en ratón dificulta el cumplimiento de los límites máximos de toxina en mariscos destinados al consumo humano ya que la toxicidad de las toxinas lipofilicas que se co-extraen con las iminas cíclicas es muy variable y distinta según las vías de administración. De hecho, la toxicidad de estas iminas cíclicas por vía intraperitoneal supera la del ácido okadaico, dinofisistoxinas, yessotoxinas, pectenotoxinas y azaspirácidos (Miles, C.O. 2007. Phycotoxins. Chemistry and Biochemistry, Botana, L.M., 159-186; Ogino, H., et al. 1997. Nat Toxins, 5, 255-9; Satake, M., et al. 1998. J Am Chem Soc, 120; Vieytes, M.R., et al. 2000. Seafood and Freshwater Toxins, Botana, L.M., 239-256), con valores de dosis letal 50 de 96 µg/Kg para la gymnodimina y 40 µg/kg para los espirólidos (Munday, R., et al. 2004. Toxicon, 44, 173-8; Richard, D., et al. 2000. Harmful Algal Blooms, 383). Sin embargo, su toxicidad por vía oral es considerablemente menor que la de las toxinas diarreicas. La detección y cuantificación de cada grupo de toxinas de forma específica permitiría cumplir los límites máximos establecidos por la legislación para cada grupo de toxinas minimizando las pérdidas económicas en el sector de la acuicultura. La segunda técnica de detección se realiza mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS). Aunque este método diferencia perfectamente las distintas toxinas requiere equipos muy costosos y sofisticados y personal técnicamente muy cualificado. Además la técnica de LC-MS no detectaria nuevos análogos de la toxina aún no caracterizados o para los que no existen estándares (muy frecuente en el campo de las toxinas marinas) y que sin embargo pueden tener una alta actividad tóxica (Fux, E., et al. 2007. J Chromatogr A, 1157, 273-80).
El mecanismo de acción de estas iminas cíclicas parece estar relacionado con la inhibición de los receptores de acetilcolina (Molgó, J., et al. 2007. Phycotoxins. Chemistry and Biochemistry., Botana, L.M., 319-335; Munday, R., et al. 2004. Toxicon, 44, 173-8; Richard, D., et al. 2000. Harmful Algal Blooms, 383; Gill, S., et al. 2003. Neurotoxicology, 24, 593-604). Ambos tipos de compuestos, gymnodiminas y espirólidos, se unen a los receptores nicotínicos de acetilcolina de forma competitiva con la a-bungarotoxina y la epibatidina. La ventaja de utilizar la monitorización de la interacción toxina-receptor nicotínico en un método de detección de iminas cíclicas es que la eficacia de la detección se correlacionaría con la actividad tóxica de cada compuesto de estos grupos.
La polarización de fluorescencia y la resonancia de plasmones superficiales son técnicas ampliamente utilizadas para la detección de interacciones a nivel molecular (Alfonso, C., et al. 2005. Anal Biochem, 344, 266-74; Kakehi, K., et al. 2001. Anal Biochem, 297, 111-6; Karlsson, R. 2004. J Mol Recognit, 17, 151-61). La polarización de fluorescencia se basa en la capacidad de las moléculas fluorescentes en solución de inducir cambios en el plano de polarización de la luz dependientes de su tamaño. La técnica requiere el marcaje fluorescente de una de las moléculas que van a interaccionar, preferiblemente la más pequeña. Dado que la polarización de la fluorescencia depende de la movilidad de la molécula y por tanto del tamaño, cuando la molécula marcada fluorescentemente interacciona con otra se produce un cambio en el tamaño del agregado y como consecuencia la polarización de la fluorescencia también cambia. La resonancia de plasmones superficiales permite la monitorización de cambios del índice de refracción inducidos por la interacción entre dos moléculas en las proximidades de una superficie detectora. Estas técnicas se usan cada vez más para cuantificar contaminantes de alimentos, ya que son relativamente sencillas y fáciles de utilizar de forma rutinaria en el laboratorio.
Descripción de la invención
Definiciones
Compuesto competidor: molécula que se une a los receptores nicotínicos de acetilcolina en los mismos sitios de unión que las iminas cíclicas.
Marcador: molécula que se une mediante un enlace covalente a otra y cuyas propiedades físicas o químicas permiten la detección mediante técnicas de laboratorio de la presencia del compuesto formado por la unión de ambas en una mezcla.
Disolución problema: cualquier disolución en la que se desee detectar la presencia o ausencia de iminas cíclicas, obtenida de la extracción de moluscos, plankton, agua de mar, o cualquier otro origen que pueda resultar de interés.
La invención tiene por objetivo proporcionar un procedimiento de cuantificación de iminas cíclicas.
El método consiste en a) poner en contacto el receptor nicotínico de la acetilcolina con una disolución problema y con un compuesto competidor; b) detectar la unión o la interacción entre el receptor nicotínico de la acetilcolina y el compuesto competidor; c) calcular la concentración de iminas cíclicas que contiene la disolución problema.
Este método se basa en que la señal detectada cuando el receptor se une al compuesto competidor será menor cuanto mayor sea la cantidad de iminas cíclicas en la disolución problema, que se unan al receptor compitiendo con el compuesto competidor e inhibiendo la unión de este último al receptor.
La disolución problema se pone en contacto con el receptor nicotínico previamente a la adicción del compuesto competidor. El tiempo que la disolución problema debe estar en contacto con el receptor nicotínico antes de la adicción del compuesto competidor puede ser desde 0 minutos a horas, dependiendo de las afinidades del compuesto competidor y del compuesto que se desea detectar en la disolución problema (iminas cíclicas) por los receptores nicotínicos.
Utilizando distintas concentraciones de patrones de iminas cíclicas, como las toxinas marinas gymnodimina o espirólidos, se obtiene una curva de calibrado que permitirá calcular la concentración de iminas cíclicas en una disolución problema a partir del grado de inhibición de la interacción compuesto competidor-receptor nicotínico.
Se trata de un procedimiento utilizable como método de criba, que detecta selectivamente iminas cíclicas. Además, al utilizar la diana biológica de las toxinas como "cebo", la eficacia de la detección de cada compuesto de este grupo de toxinas se correlacionaría con la actividad tóxica "in vivo".
De un modo particular, el compuesto competidor se selecciona preferentemente entre la a-bungarotoxina, a-conotoxinas, cobratoxina, iminas cíclicas o epibatidina.
De otro modo particular, el compuesto competidor se marca preferiblemente con los siguientes marcadores Alexa Fluor® 488, tetramethylrhodamina, AlexaFluor® 555, AlexaFluor® 680, AlexaFluor® 647 AlexaFluor® 594, Oregon Green® 514, fluoresceína, Texas Red®-R, biotina, HRP (horseradish peroxidase), yodo radiactivo o tritio.
La unión o la interacción entre el receptor nicotínico y el compuesto...
Reivindicaciones:
1. Procedimiento de cuantificación de iminas cíclicas que comprende
a) poner en contacto el receptor nicotínico de la acetilcolina con una disolución problema y con un compuesto competidor; b) detectar la unión o la interacción entre el receptor nicotínico de la acetilcolina y el compuesto competidor; c) calcular la concentración de iminas cíclicas que contiene la disolución problema.
2. Procedimiento de cuantificación de iminas cíclicas según la reivindicación 1 apartado a), en donde el compuesto competidor se selecciona preferiblemente entre a-bungarotoxina, a-conotoxinas, cobratoxina, iminas cíclicas o epibatidina.
3. Procedimiento de cuantificación de iminas cíclicas según la reivindicación 1 y 2, en donde el compuesto competidor se marca preferiblemente con los siguientes marcadores AlexaFluor® 488, tetramethylrhodamina, AlexaFluor® 555, AlexaFluor® 680, AlexaFluor® 647 AlexaFluor® 594, Oregon Green® 514, fluoresceína, Texas Red®-R, biotina, HRP (horseradish peroxidase), yodo radiactivo o tritio.
4. Procedimiento de cuantificación de iminas cíclicas según las reivindicaciones anteriores, en donde el método de detección se selecciona entre
5. Procedimiento de cuantificación de iminas cíclicas según las reivindicación 1 apartado c) en donde el cálculo de la concentración de iminas cíclicas en la disolución problema se realiza mediante una recta de calibrado.
6. Kit para la cuantificación de iminas cíclicas que comprende al menos el receptor nicotínico de la acetilcolina y un compuesto competidor en la unión con el receptor nicotínico de la acetilcolina.
7. Kit para la cuantificación de iminas cíclicas según la reivindicación 6, donde el compuesto competidor se selecciona preferiblemente entre a-bungarotoxina, a-conotoxinas, cobratoxina, iminas cíclicas o epibatidina.
8. Kit para la cuantificación de iminas cíclicas según la reivindicación 6 y 7, donde el compuesto competidor se marca preferentemente con AlexaFlúor 488, AlexaFluor® 488, tetramethylrhodamina, AlexaFluor® 555, AlexaFluor® 680, AlexaFluor® 647 AlexaFluor® 594, Oregon Green® 514, fluoresceína, Texas Red®-R, biotina, HRP (horseradish peroxidase), yodo radiactivo o tritio.
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