DETECCION DE MARCADORES NITRADOS ESPECIFICOS.

Un método para llevar a cabo un inmunoensayo cualitativo o cuantitativo para la oxidación de proteínas,

que comprende detectar en una muestra una secuencia de aminoácidos que es característica de una proteína específica presente en un tejido articular y que contiene uno o más residuos de aminoácidos aromáticos en forma nitrada, donde el ensayo comprende, detectar el enlace de un asociado de enlace inmunológico que es inmunoreactivo con dicha forma nitrada de dicho residuo de aminoácido aromático

Detección de marcadores nitrados específicos.

La presente invención se relaciona con un método para llevar a cabo un ensayo cualitativo o cuantitativo que puede ser usado para detectar cuantificar o monitorizar el deterioro oxidativo especialmente en relación con una condición inflamatoria. La detección de proteínas o fragmentos de las mismas específicas nitradas contra las proteínas equivalentes o fragmentos de las mismas equivalentes no nitradas, puede servir como un índice del deterioro oxidativo por ejemplo en enfermedades inflamatorias intestinales, lupus eritematoso sistémico, artritis, cáncer, enfermedades de Parkinson o de Alzheimer.

A través de su tiempo de vida los organismos enfrentan numerosos eventos y condiciones que generan especies de oxígeno reactivas (ROS). Un incremento en la rata de los organismos de producción de los ROS o un descenso en su rata de consumo incrementarán la modificación oxidativa de las moléculas celulares, incluyendo ADN y proteínas. La oxidación puede tener efectos nocivos sobre la función y estabilidad de las proteínas. Muchas enzimas han demostrado perder su actividad biológica como consecuencia de la oxidación. Otros efectos de la oxidación son estabilidad disminuida a la temperatura y cambios en la susceptibilidad en la proteína hacia la proteólisis; esta última puede llevar a una acumulación de proteínas oxidadas incapaces de sufrir degradación. La oxidación de las proteínas puede estar implicada en la patogénesis de varias enfermedades tales como enfermedades neurodegenerativas, cánceres, arterioesclerosis, cataratogénesis, displasia, distrofia y enfermedades inflamatorias así como en el envejecimiento normal.

Algunos de los procesos y sistemas generadores de ROS comunes conocidos por modificar las proteínas son la irradiación, la inflamación, la reacciones catalizadas por metales tales como Fe (II) o Cu (I) por reducción y diversos otros compuestos oxidantes o radicales libres, incluyendo óxido nítrico (NO), peroxi itrito, H₂O₂ o hidroxilo, hidroxiperoxilo superóxido y radicales peróxilo de lípidos. Un buen número de ROS se forman por sistemas enzimáticos específicos tales como óxido nítrico sintetasa (NOS), ciclo oxigenasa y mono amino oxidasa B, algunos de los cuales son inducidos bajo condiciones inflamatorias.

Bajo condiciones normales el potencial oxidativo en el microambiente de un organismo está bajo estrecho control mediante un número de sistemas de balance que incluye antioxidantes, consumidores de radicales libres, reductasas, peroxidasas, catalasa, glutatión-S-transferasa, superóxido dismutasa y diversas proteínas enlazantes de metales. Estos sistemas pueden verse como mecanismos de protección, más que sistemas de reparación. Los mecanismos específicos de reparación corrientes para las proteínas oxidativas dañadas son raros, mientras que el daño oxidativo a los ácidos nucleicos está sujeto a sistemas de reparación altamente eficientes (Stadtman and Levine 2000).

El óxido nítrico (NO) es producido en muchos tejidos y regula diversas funciones, tales como la relajación de los músculos lisos, defensa no específica contra microorganismos, neurotransmisor y un posible modulador de la matriz de los cartílagos. La óxido nítrico sintetasa (NOS) es responsable de la producción de NO. Hay dos clases de NOS, uno constitutivo (cNOS) y uno inducible (iNOS). La actividad de los iNOS aparece en respuesta a diversas citoquinas, y produce una cantidad mucho más grande de NO que las cNOS. La actividad de las iNOS se cree que tiene un papel en los efectos proinflamatorios del NO, como se ve en condiciones tales como enfermedades inflamatorias del intestino, inflamación espontánea del estómago, inflamación cardiovascular y enfermedades artríticas (osteoartritis (OA) o artritis reumatoide (RA)).

La gran citotoxicidad del NO se debe parcialmente a su capacidad para reaccionar con el anion superoxido (O₂^-) para generar el anión peroxinitrito (ONOO-) y su ácido conjugado, el ácido peroxinitroso (ONOOH). En pH neutro el ONOO- es protonado parcialmente, generando ONOOH, el cual rápidamente se descompone a nitrato. Estos fuertes oxidantes pueden comprometer seriamente la regulación celular, y son capaces de nitrar los compuestos aromáticos tales como fenilalanina libre, tirosina y triptófano, así como cadenas de péptidos que contengan estos aminoácidos. Esto resulta en nitrofenilalanina, nitrotiptófano y nitrotirosina, pudiendo la última ser generada a través de la hidroxilación y nitración combinada del residuo de fenilalanina (Lin et al 2000). La nitración es irreversible e inhibe la fosforilación de los residuos de tirosina y triptófano, interfiriendo así con los caminos de transducción de la señal.

En OA y RA, el NO es producido en grandes cantidades por los condrocitos, macrófagos y el sinovio inflamado. Se ha encontrado un alto nivel de nitrito/nitrato en el fluido sinovial, suero y orina de pacientes con OA y RA (Lotz 1999). Sin embargo, los niveles elevados de NO no pueden considerarse como un marcador específico para cualquier enfermedad o condición dada, puesto que diferentes procesos y tejidos pueden dar lugar a niveles sistémicos de NO elevados.

La principal manifestación clínica de RA así como de OA es un cartílago anormal y degradado. Sin embargo, hasta ahora ha sido difícil establecer directamente la destrucción en marcha de cartílagos en pacientes con artritis, porque los marcadores específicos para este proceso no han estado disponibles en la práctica clínica. En el diagnóstico clínico de OA y RA, el daño al cartílago en las articulaciones es registrado por rayos X, los cuales revelan una pérdida del espacio articular a medida que el cartílago es destruido y perdido. Adicionalmente los pacientes son clasificados de acuerdo con el dolor y problemas de movilidad causados por la destrucción de las articulaciones, pero aunque se han introducido un buen número de sistemas de clasificación estandarizados, es difícil cuantificar estos parámetros. Otros marcadores utilizados para la definición de los pacientes de RA, tales como la proteína C-reactiva y los factores reumatoides están asociados con los procesos inflamatorios involucrados en la enfermedad, pero probablemente no están relacionados directamente con el nivel de destrucción de cartílago y nos son específicos para RA.

La detección de los metabolitos, tales como la proteína de matriz oligomérica del cartílago (COMP), hialuronatos, agrecan y colágeno tipo II o III en forma de fragmentos que surgen de la destrucción de las articulaciones afectadas por la enfermedad inflamatoria han sido reportados (Moller 1998, Wolheim 1996, patente de los Estados Unidos No. 5919634, patente de los Estados Unidos No. 6132976 y solicitud PCT WO 01/38872). La inutilidad médica de estos marcadores, sin embargo, aún debe ser probada.

La detección de aminoácidos modificados por NO₂ es conocida de acuerdo con las solicitudes de patente PCT WO 96/04311 y WO 98/29452. Estas solicitudes de patente divulgan la detección independiente de secuencias de un residuo de nitrotirosina o nitrotiptófano en una proteína o en su forma libre utilizando un anticuerpo, el cual específicamente reconoce el grupo nitro. Tal anticuerpo puede ser utilizado para establecer una condición patológica relacionada con un nivel anormal de nitrotirosina. Sin embargo el anticuerpo no será capaz de establecer el problema en relación con un tejido o proteína específica puesto que reconoce la nitrotirosina independientemente de la secuencia de aminoácido circundante.

D.C.Paik in Connective Tissue Research vol 42 (2) p 111 (2001) describe un método para establecer el nivel de daño de colágeno inducido por óxido nítrico/ion nitrito con base en la detección de la cantidad de nitrotirosina en colágeno por HPLC.

La WO 01/84160 A2 describe un método para identificar la modificación oxidativa de una proteína determinando la nitrotirosina por espectrometría de masas.

WO 01/49558 A1 dibuja un método para detectar anticuerpos endógenos contra MAG producido por pacientes que sufren de enfermedades Autoinmunes.

La presente invención se relaciona con métodos para cuantificar los aminoácidos modificados por NO₂ dentro del contexto específico de una proteína o fragmentos de la misma. La determinación de tales proteínas nitradas específicas o fragmentos de las mismas permite un establecimiento del daño oxidativo y del estado metabólico de una proteína dada. Esto proporciona pruebas diagnósticas, las cuales asocian...

1. Un método para llevar a cabo un inmunoensayo cualitativo o cuantitativo para la oxidación de proteínas, que comprende detectar en una muestra una secuencia de aminoácidos que es característica de una proteína específica presente en un tejido articular y que contiene uno o más residuos de aminoácidos aromáticos en forma nitrada, donde el ensayo comprende, detectar el enlace de un asociado de enlace inmunológico que es inmunoreactivo con dicha forma nitrada de dicho residuo de aminoácido aromático.

2. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1, donde dicho asociado de enlace inmunológico es especialmente reactivo con dicha forma nitrada de dicho residuo de aminoácido aromático en el contexto de dicha secuencia de aminoácidos que es característica de una proteína específica.

3. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1, donde dicho asociado de enlace inmunológico es reactivo con dicha forma nitrada de dicho residuo de aminoácido aromático en un contexto de manera independiente y dicho ensayo comprende detectar el enlazamiento de dicho asociado de enlace inmunológico y dicho segundo asociado de enlace inmunológico a las secuencias de aminoácidos nitrados en formato de intermediación, donde dicho segundo asociado de enlace inmunológico tiene especificidad de enlace para una secuencia de aminoácidos que es característica de dicha proteína específica.

4. Un método como el reivindicado en la reivindicación precedente donde dicha proteína es colágeno de tipo I, II, III, VI, IX u XI, agrecan, proteína de enlace de cartílago, proteína oligomérica de cartílago, o proteína de capa intermedia de cartílago.

5. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho residuo o residuos de aminoácidos aromáticos nitrados es/son nitrotirosina o nitrotriptófano.

6. Un método como el reivindicado en la reivindicación 5, donde la secuencia de aminoácidos que es detectada comprende la secuencia HRGYPLDG en la cual el residuo de aminoácidos Y es tirosina nitrada o está comprendido dentro de dicha secuencia e incluye dicha tirosina nitrada.

7. Un método como el reivindicado en la reivindicación 5, donde la secuencia de aminoácidos que es detectada comprende la secuencia LQYMRA en la cual el residuo de aminoácido Y es tirosina nitrada o está comprendido dentro de dicha secuencia e incluye dicha tirosina nitrada.

8. Un asociado de enlace inmunológico específicamente reactivo con la forma nitrada de un residuo de aminoácido aromático en el contexto de una secuencia de aminoácidos que es característica de una proteína específica que tiene especificidad de enlace para un epítopo contenido en la secuencia de aminoácidos HRGY:NO₂PGLDG epítopo que contiene el residuo de aminoácido Y:NO₂ y es característico del colágeno tipo II.

9. Un asociado de enlace inmunológico como se reivindica en la reivindicación 8, el cual es un anticuerpo que surge contra un péptido que tiene la secuencia (Xaa)_m HRGY:NO₂PGLDG (Xaa)_n, donde X denota cualquier aminoácido o derivado del mismo y m y n son enteros independientes de 1 a 10.

10. Un asociado de enlace inmunológico específicamente reactivo con la forma nitrada de un residuo de aminoácido aromático en el contexto de una secuencia de aminoácidos que es característica de una proteína específica, que tiene especificidad de enlace para un epítopo contenido en la secuencia de aminoácidos LQY:NO₂MRA epítopo que contiene el residuo de aminoácido Y:NO₂ y es característico del colágeno tipo II.

11. Un asociado de enlace inmunológico como se reivindica en la reivindicación 10, que es un anticuerpo que surge contra un péptido que tiene la secuencia (Xaa)_m LQY: NO₂MRA(Xaa)_n, donde X denota cualquier aminoácido derivado del mismo y n y m son enteros independientes de 1 a 10.

12. Un asociado de enlace inmunológico como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, el cual es un anticuerpo monoclonal.

13. Una línea celular que produce un anticuerpo monoclonal como se reivindica en la reivindicación 12.

14. Un método para la investigación de la existencia o alcance del daño oxidativo que comprende medir en una muestra biológica las cantidades relativas de formas nitradas y no nitradas de una secuencia de aminoácidos que es característica de una proteína específica derivada de la matriz de cartílago y que contiene uno o más residuos de aminoácidos aromáticos nitrables, poniendo en contacto una muestra biológica de un individuo o una porción de tal muestra con un primer asociado de enlace inmunológico el cual se enlaza a dicha forme nitrada de dicha secuencia de aminoácidos y determinar cuantitativamente dicho enlace; poner en contacto la muestra biológica o una porción de la misma con un segundo asociado de enlace inmunológico el cual se enlaza con dicha forma no nitrada de dicha secuencia de aminoácidos y determinar cuantitativamente dicho enlace; determinar una proporción entre dichas determinaciones para proveer una relación de las cantidades relativas de dichas formas nitradas y no nitradas de dicha secuencia presentes en la muestra; y comparar el valor medido con valores característicos de individuos saludables o individuos de patología conocida.

15. Un método como el reivindicado en la reivindicación 14, donde dicho primer asociado de enlace inmunológico es como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12.

16. Un kit para uso en la ejecución de un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 14 y 15 y que comprende: un asociado de enlace inmunológico que se enlaza específicamente con la forma nitrada de un residuo de aminoácido aromático en el contexto de una secuencia de aminoácidos que es característica de una proteína específica presente en el tejido articular; y medios para detectar el enlace de dicho asociado de enlace con dicha forma nitrada de dicho residuo de aminoácido aromático.

17. Un kit como el reivindicado en la reivindicación 16, donde el asociado de enlace inmunológico es como se reivindicó en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12.

18. Un kit como el reivindicado en la reivindicación 16 o reivindicación 17, que incluye un asociado de enlace inmunológico que es reactivo con la dicha secuencia de aminoácidos en la forma no nitrada.

19. Un kit como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, que comprende un péptido reactivo con un dicho asociado de enlace inmunológico.