Cultivo celular en esferas de hidrogel con alginato de quitosano.

Un método de producción de una matriz de hidrogel que comprende células formadoras de cartílago,

comprendiendo dicho método las etapas de:

- proporcionar una solución de alginato,

- proporcionar una solución con quitosano que tiene un Pm inferior a 60 kDa,

- mezclar la solución de alginato y la solución de quitosano con células formadoras de cartílago, en donde

dicha solución mixta comprende entre el 0,5 y el 0,7 % (p/v) de quitosano y entre el 1 y el 1,4 % de alginato (p/v),

- introducir gotas de la solución mixta en una solución con cationes de Ca2+ o Sr2+ y

- aislar esferas polimerizadas de la solución con cationes.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2011/052013.

Solicitante: UNIVERSITE DE LIEGE.

Nacionalidad solicitante: Bélgica.

Dirección: Patent Department, Avenue Pré-Aily, 4 4031 Angleur (Liege) BELGICA.

Inventor/es: HENROTIN,YVES, KESTELOOT,FRÉDÉRIC, SANCHEZ,CHRISTELLE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61L27/20 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61L PROCEDIMIENTOS O APARATOS PARA ESTERILIZAR MATERIALES U OBJECTOS EN GENERAL; DESINFECCION, ESTERILIZACION O DESODORIZACION DEL AIRE; ASPECTOS QUIMICOS DE VENDAS, APOSITOS, COMPRESAS ABSORBENTES O ARTICULOS QUIRURGICOS; MATERIALES PARA VENDAS, APOSITOS, COMPRESAS ABSORBENTES O ARTICULOS QUIRURGICOS (conservación de cuerpos o desinfección caracterizada por los agentes empleados A01N; conservación, p. ej. esterilización de alimentos o productos alimenticios A23; preparaciones de uso medico, dental o para el aseo A61K). › A61L 27/00 Materiales para prótesis o para revestimiento de prótesis (prótesis dentales A61C 13/00; forma o estructura de las prótesis A61F 2/00; empleo de preparaciones para la fabricación de dientes artificiales A61K 6/02; riñones artificiales A61M 1/14). › Polisacáridos.
  • A61L27/38 A61L 27/00 […] › Células animales (para utilizar en piel artificial A61L 27/60).

PDF original: ES-2526592_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Cultivo celular en esferas de hidrogel con alginato de quitosano Campo de la invención

La presente invención se refiere a armazones para el cultivo de células formadoras de cartílago, más en concreto a condrocitos. La presente invención se refiere además a esferas celularizadas para la implantación. La presente invención se refiere además a métodos y herramientas para la reparación del cartílago.

Antecedentes de la invención

Las células formadoras de cartílago aisladas y expandidas se han utilizado para implantación desde hace varias décadas. La expansión in vitro para obtener una cantidad suficiente de células, sin embargo, puede dar lugar a células que, tras la implantación, tiene como resultado la muerte celular, tejido cicatrizal o células hiperdiferenciadas. Este es especialmente el caso de la reparación de cartílago, en la que el cultivo de condrocitos, tras la implantación, a menudo produce material fibroso o similar al hueso en lugar del cartílago hialino previsto.

Se han realizado intentos para cultivar células de condrocitos en una matriz tridimensional en la que se reproduce la matriz extracelular del cartílago. Se han usado diversos geles en los que se cultivan células. Por ejemplo, la técnica anterior divulga esferas con un núcleo de alginato y un recubrimiento de quitosano (Babister et al. (28) Biomaterials 29, 58-65).

Los métodos para preparar esferas de hidrogel se pueden dividir en tres grupos. Un primer tipo se refiere a matrices porosas que están pobladas por células. En el presente documento, la matriz tiene un tamaño de poro grande para permitir la migración de las células al interior de la matriz. Li et al. (28) J. Biomed. Mater. Res. A. 86, 552-559, describen un armazón poroso que contiene 2,4 % de alginato/2,4 % de quitosano que después se siembra con células.

A medida que las células migran desde el exterior al interior de la matriz, estas matrices a menudo tienen muchas células en las células externas y una cantidad baja de células en el interior.

En un segundo tipo de métodos, las células se mezclan con un constituyente de la matriz, tras lo cual se está formando la matriz. Bernstein et al. (29) Biotechnol. Prog. 25, 1146-1152, describen métodos en los que se forman esferas con 2,5 % de alginato y 1,4 % de quitosano. El cartílago en el interior se describe como de baja calidad. En un tercer método, como se ¡lustra en el documento W27/135114, las células están encapsuladas en una solución gelificante obtenida de una solución acuosa de una mezcla de un polisacárido tal como alginato y un derivado oligosacárido de quitosano altamente ramificado. La solución acuosa se gelifica con agentes gelificantes con el objetivo de encapsular las células.

En cada tipo de los métodos, la elección del hidrogel tiene un fuerte impacto sobre el fenotipo de las células y después sobre la calidad del implante. En particular, en el hidrogel del documento W27/135114, el derivado oligosacárido de quitosano tiene un grado de derivación de al menos un 4 % y la mezcla polisacárida o la mezcla de alginato tiene una fuerza iónica que no es óptima para mantener las células vivas. Adicionalmente, estra matriz 3D no mantiene el fenotipo de los condrocitos estables, como se muestra mediante un incremento de proliferación celular y una disminución de la síntesis de agrecano.

Existe la necesidad de mejoras adicionales en la selección del material de la matriz y en los métodos para producir implantes celularizados.

Sumario de la invención

Un aspecto de la presente invención se refiere a métodos de producción de una matriz de hidrogel que comprende células formadoras de cartílago que comprenden las etapas de:

- proporcionar una solución de alginato,

- proporcionar una solución con quitosano que tiene un Pm inferior a 6 kDa,

- mezclar la solución de alginato y la solución de quitosano con células formadoras de cartílago, en la que la solución mixta comprende entre ,5 y ,7 % (p/v) de quitosano y entre 1 y 1,4 % de alginato (p/v).

- introducir gotas de la solución mixta en una solución con cationes de Ca2+ o Sr2* y

- aislar las esferas gelificadas de la solución con cationes.

En determinadas realizaciones de métodos de la presente invención, las gotas de la solución mixta se introducen en una solución de iones Sr2*.

En realizaciones concretas de este método, la solución mixta comprende ,6 % de quitosano y o comprende 1,2 % de alginato.

En realizaciones concretas de métodos de la presente invención, la proporción entre alginato y quitosano en la solución mixta es de entre 1,4 y 2,8 o entre 1,75 y 2,25 o es de aproximadamente 2.

En realizaciones concretas de métodos de la presente invención, el quitosano tiene un Pm de entre 35 y 45 kDa y/o es de origen animal o, preferentemente, vegetal.

En otras realizaciones concretas de los métodos de la presente invención, el método comprende además la etapa de cultivar las esferas que comprenden células formadoras de cartílago en un medio de crecimiento. Dicho cultivo se puede realizar durante hasta 7, 14, 21 o incluso 28 días.

En otras realizaciones concretas de métodos de la presente invención, el medio de crecimiento comprende suero.

En otras realizaciones concretas de métodos de la presente invención, la formación de esferas se realiza pasando gotas a través de una aguja para obtener una partícula con un diámetro entre aproximadamente ,2 y 5 mm.

En otras realizaciones concretas de los métodos de la presente invención, el método comprende además la etapa de mezclar las esferas cultivadas en un hidrogel termosensible. En el presente documento, la proporción entre las esferas y los hidrogeles está, por ejemplo, entre 5/1 y 1/1, o entre 4/1 y 2/1.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una esfera de hidrogel esférico que comprende una mezcla homogénea de quitosano y alginato y que además comprende células formadoras de cartílago, en el que dicha esfera se puede obtener mediante los métodos como se ha descrito anteriormente.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una esfera de hidrogel esférico con un diámetro entre ,1 y 5 mm, que comprende una mezcla homogénea de quitosano y alginato y que además comprende células formadoras de cartílago dentro de la matriz, caracterizado por que la esfera comprende entre 1 y 1,4 % de alginato y entre ,5 y ,7 % de quitosano, por ejemplo, la esfera comprende 1,2 % de alginato, o, por ejemplo, la esfera comprende ,6 % de quitosano.

En realizaciones concretas de esferas de la presente invención, la proporción de alginato/quitosano está entre 1,4 y 2,8, o entre 1,75 y 2,25, o entre 1,8 y 2,2.

En otras realizaciones concretas de esferas de la presente invención, el quitosano tiene un Pm entre 35 y 45 kDa.

En otras realizaciones concretas de esferas de la presente invención, las células formadoras de cartílago tienen una concentración de entre 5. o 6. a 1. o 15. células por esfera.

En otras realizaciones concretas de esferas de la presente invención, las células formadoras de cartílago, tras 21 días de cultivo, expresan menos de ,5 pg de lactato deshidrogenasa (LDH) o las células formadoras de cartílago, tras 21 días de cultivo, expresan menos de ,2 unidades de fosfatasa alcalina por ng de LDH, cuando creen en presencia de suero.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a células formadoras de cartílago comprendidas en una esfera como se describe o produce como se ha descrito anteriormente para su uso en la reparación de los defectos de cartílago, tal como artrosis.

Ventajas de las esferas como se preparan en la presente invención y su uso:

En los métodos de transplante de cartílago de la técnica anterior se recogen un número bajo de condrocitos autólogos de las biopsias de cartílago que proceden de áreas normales de cartílago y después s cultivan en monocapa para proliferación hasta que se obtiene un número óptico de células para injerto. Cuando se cultivan en monocapa, los condrocitos pierden de forma progresiva su fenotipo y no forman una matriz extracelular cartilaginosa y se convierten en fibroblastos que producen principalmente tejido cicatricial. Para evitar este procesóte desdiferenciación o para estimular la rediferenciación celular tras el cultivo de monocapa, los condrocitos se pueden cultivar en una matriz tridimensional, tal como esferas de alginato. No obstante, en las esferas de alginato, los condrocitos sufren una diferenciación hipertrófica y mineralizan la matriz circundante. La diferenciación hipertrófica y la mineralización de la matriz son efectos indeseables asociados con la artrosis.... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método de producción de una matriz de hidrogel que comprende células formadoras de cartílago, comprendiendo dicho método las etapas de:

- proporcionar una solución de alginato,

- proporcionar una solución con quitosano que tiene un Pm inferior a 6 kDa,

- mezclar la solución de alginato y la solución de quitosano con células formadoras de cartílago, en donde dicha solución mixta comprende entre el ,5 y el ,7 % (p/v) de quitosano y entre el 1 y el 1,4 % de alginato (p/v),

introducir gotas de la solución mixta en una solución con cationes de Ca2+ o Sr2+ y

- aislar esferas polimerizadas de la solución con cationes.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha solución mixta comprende el ,6 % de quitosano.

3. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicha solución mixta comprende el 1,2 % de alginato.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el alginato y el quitosano en dicha solución mixta están presentes en una proporción entre 1,75 y 2,25.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho quitosano tiene un Pm de entre 35 y 45 kDa.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que además comprende la etapa de cultivar en un medio de crecimiento dichas esferas que comprenden células formadoras de cartílago.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho medio de crecimiento comprende suero.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas gotas se pasan a través de una aguja para obtener una partícula con un diámetro entre ,1 a 5 mm.

9. Una esfera de hidrogel esférica con un diámetro entre ,1 y 5 mm, que comprende una mezcla homogénea de alginato y quitosano de Pm inferior a 6 kDa y que además comprende células formadoras de cartílago dentro de dicha matriz, caracterizada por que dicha esfera comprende entre el 1 y el 1,4 % p/v de alginato y entre el ,5 y el

,7 % p/v de quitosano.

1. La esfera de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicha esfera comprende 1,2 % p/v de alginato.

11. La esfera de acuerdo con las reivindicaciones 9 o 1, en donde dicha esfera comprende el ,6% p/v de quitosano.

12. La esfera de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde el quitosano tiene un Pm de entre 35 y 45 kDa.

13. La esfera que comprende células formadoras de cartílago de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 para su uso en la reparación de los defectos del cartílago.


 

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