Una prueba de marcador genético para braquispina y fertilidad en ganado vacuno.

Un método para determinar si un bovino está afectado por o es portador de braquispina (BS) analizando suADN genómico,

el método comprende los pasos de:

a) extraer el ADN de una muestra de material biológico que contiene dicho ADN genómico obtenido delbovino,

b)i) genotipar dicho ADN para SNP localizados en el intervalo entre las posiciones de nucleótidos 20156961y 22499122 en el cromosoma bovino 21, Btau_4, y

c) determinar si dicho animal tiene el haplotipo de riesgo de braquispina.

Una prueba de marcador genético para braquispina y fertilidad en ganado vacuno Campo de la invención Esta invención se refiere a métodos para la detección de bovinos que están afectados por o son portadores de braquispina (BS) , un defecto heredado con herencia autosómica recesiva. La presente invención proporciona un método para determinar si un bovino está afectado por o es portador de BS analizando su ADN genómico o su ARN. El método incluye obtener una muestra de material que contenga ADN genómico o ARN del bovino, determinar el genotipo dicho ácido nucleico para uno o más marcadores SNP que definen el haplotipo diagnóstico de BS, y determinar si dicho animal tiene el haplotipo diagnóstico lo que indica que está afectado por o es portador de BS.

Descripción de los antecedentes técnicos La selección intensa para rasgos de producción deseados en ganado con frecuencia produce una tasa aumentada de endogamia. Esto causa la aparición frecuente de defectos heredados que algunas veces afectan a tal alta proporción de la población que se convierte en un asunto principal. Los ejemplos de defectos genéticos que han causado problemas principales en ganado son la deficiencia de adhesión de leucocitos bovina (BLAD) (1) y la malformación vertebral congénita (CVM) (2) .

La mayoría de estos trastornos de caracterizan por un modo recesivo de herencia: los animales pueden ser homocigotos para el alelo normal (+/+) , homocigotos para el alelo defectuoso (D/D) o heterocigotos (+/D) . Los animales D/D están afectados por la enfermedad, mientras que los animales +/+ y +/D generalmente están sanos. Sin embargo, se dice que los animales +/D son “portadores” y transmitirán el alelo D a la mitad de su descendencia. El apareamiento entre dos animales portadores producirá un cuarto de la descendencia D/D afectada.

Si se pudieran identificar los animales +/D a pesar del hecho de que no muestran síntomas de la enfermedad, sería posible eliminarlos de los programas de reproducción o al menos evitar apareamientos entre portadores. Esto permitiría la erradicación inmediata del defecto genético de la población y evitaría las pérdidas económicas asociadas con ella.

Recientemente se ha vuelto posible identificar rápidamente los genes subyacentes a defectos genéticos y las mutaciones en ellos que producen que un alelo sea D (efectuoso) (3) . El procedimiento más comúnmente usado es la clonación posicional que comprende dos pasos. En un primer caso el gen D (efectuoso) se localiza en el genoma a través de la identificación de un segmento cromosómico que es “homocigoto por ascendencia” compartido por todos los individuos afectados en una población determinada. Para ese fin se determina el genotipo de los individuos afectados para decenas de miles de polimorfismos de nucleótido único (SNP) polimórficos dispersos a lo largo del genoma. La mutación que produce el alelo D apareció en un cromosoma específico que se caracteriza por un “haplotipo” único, es decir, combinación de alelos en los SNP alrededor de la mutación. Los individuos afectados han heredado la mutación causal de ambos padres y con ella el haplotipo diagnóstico, por tanto la homocigosis compartida en la región cromosómica correspondiente. En un segundo caso, el gen y la mutación causales se identifican por examen molecular detallado de la región cromosómica “homocigota por ascendencia” compartida.

Desde un punto de vista diagnóstico, la detección de individuos portadores +/D se puede hacer en base a la detección de haplotipo diagnóstico o mejor la mutación causal.

Los mamíferos son diploides, lo que significa que tienen dos haplotipos en cada región cromosómica, uno paterno y uno materno. La superposición de los dos haplotipos puede hacer borrosa la interpretación como se ilustra en la figura 1. Para determinar si un individuo tiene un haplotipo definido en una posición del mapa determinada se necesita desenmarañar los haplotipos paterno y materno, un procedimiento conocido como “ajuste de fases”. Esto se puede hacer en base a los genotipos parentales disponibles, genotipos de la descendencia, desequilibrio de ligamiento a lo largo de una población o una combinación de estas diferentes fuentes de información. Nótese que incluso si el ajuste fases exacto es imposible, la presencia de un haplotipo específico con frecuencia se puede excluir solo de los análisis de los genotipos sin ajuste de fases.

En 2006 se describió un síndrome letal desconocido hasta entonces en un ternero Holstein danés (Agerholm JS, McEvoy F, Arnbjerg J: Brachyspina syndrome in a Holstein calf. J Vet Diagn Invest 2006, 18:418-422) . El síndrome se caracterizaba por peso corporal severamente reducido, retraso del crecimiento, malformaciones vertebrales graves asociadas con un acortamiento significativo de la columna vertebral (braquispina) y extremidades largas y delgadas. Además, los animales afectados muestran braquignatismo inferior así como malformación de los órganos internos, en particular el corazón, los riñones y los testículos (4) como se muestra en la figura 2. La causa del síndrome no se pudo determinar. Puesto que el ternero era el resultado del apareamiento artificial entre animales genéticamente relacionados y fenotípicamente normales y como era el único ternero afectado que se produjo en un rebaño de 96 hembras adultas, se podría especular que el incidente se produjo por transmisión por ascendencia de un alelo recesivo defectuoso de un antepasado común. Se identificaron casos adicionales después mediante el

Programa Danés de Enfermedades Genéticas Bovinas (Agerholm JS, Basse A, Christensen K: Investigations on the occurrence of hereditar y diseases in the Danish cattle population 1989-1991. Acta Vet Scand 1993, 34:245-253) . Pero de nuevo, la causa de la enfermedad no se pudo determinar. Una revisión de Whitlock et al. (Theriogenology, 2008, 70 (3) : 535-549) discute las etiologías para las anomalías fetales bovinas congénitas y describe seis casos de síndrome de braquispina en la bibliografía antes de la braquispina.

Compendio de la invención En vista de lo anterior, el problema técnico subyacente a la presente invención era proporcionar medios y métodos que permitan un diagnóstico selectivo y conveniente de braquispina o del estado de portador para esta enfermedad en ganado vacuno.

La solución a dicho problema técnico se alcanza mediante las formas de realización caracterizadas en las reivindicaciones.

La presente invención proporciona por primera vez la localización cromosómica del gen que produce braquispina, y se describen haplotipos SNP que están “asociados” con el alelo D y que se pueden utilizar para detección altamente precisa de portadores +/D.

Por tanto, la presente invención proporciona en una primera forma de realización:

un método para determinar si un bovino está afectado por o es portador de braquispina (BS) analizando su ADN genómico, el método comprende los pasos de:

a) extraer ADN de una muestra de material biológico que contiene dicho ADN genómico obtenido del bovino, b) i) genotipar dicho ADN para SNP localizados en el intervalo entre las posiciones de nucleótidos 20156961 y

22499122 en el cromosoma bovino 21, Btau_4.0, y c) determinar si dicho animal tiene el haplotipo de riesgo de braquispina.

El término “bovino” según la presente invención abarca todo el ganado vacuno o razas de ganado vacuno de la especie bos taurus. En una forma de realización preferida de los métodos de la presente invención el bovino se selecciona del grupo que consiste en Holstein, Friesian, y razas cruzadas Holstein-Friesian, Friesian británica y/o danesa.

El término “portador de braquispina (BS) ” se refiere a un bovino que tiene una mutación que produce el defecto braquispina en uno de sus cromosomas (sea heredado del padre o la madre) , y un alelo de tipo salvaje en el otro cromosoma. La mutación que produce braquispina está localizada en el cromosoma bovino 21 en el intervalo entre las posiciones de nucleótidos 20156961 y 22499122 (Btau_4.0) .

El término “muestra” o “muestra biológica” según la presente invención se refiere a cualquier material que contiene células nucleadas de dicho bovino que se va a ensayar. En una forma de realización preferida la muestra biológica que se va a usar en los métodos de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en sangre, semen, raíces capilares, leche, líquidos corporales así como tejidos que incluyan células nucleadas.

Los métodos de extracción/aislamiento y purificación de ADN son bien conocidos en la técnica... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar si un bovino está afectado por o es portador de braquispina (BS) analizando su ADN genómico, el método comprende los pasos de: 5 a) extraer el ADN de una muestra de material biológico que contiene dicho ADN genómico obtenido del bovino, b) i) genotipar dicho ADN para SNP localizados en el intervalo entre las posiciones de nucleótidos 20156961

y 22499122 en el cromosoma bovino 21, Btau_4, y c) determinar si dicho animal tiene el haplotipo de riesgo de braquispina.

2. Un método para determinar si un bovino está afectado por o es portador de braquispina (BS) analizando su ARN, el método comprende los pasos de:

a) extraer el ARN de una muestra de material biológico que contiene dicho ARN obtenido del bovino, b) i) genotipar dicho ARN para SNP localizados en el intervalo entre las posiciones de nucleótidos 20156961 y 22499122 en el cromosoma bovino 21, Btau_4, y c) determinar si dicho animal tiene el haplotipo de riesgo de braquispina. 10

3. El método de la reivindicación 1 o 2 que comprende además el paso de:

b) ii) ajuste de fases del genotipo SNP de dicho bovino.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde los SNP utilizados son como se definen en la 15 tabla 1.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la identificación de al menos un SNP es indicativa de braquispina en dicho bovino.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la identificación de al menos 5 SNP es indicativa de braquispina en dicho bovino.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, semen, raíces capilares, leche, líquidos corporales y/o tejidos que incluyen células 25 nucleadas.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el bovino se selecciona de la especie bos taurus.

9. El método según la reivindicación 8 en donde el bovino se selecciona del grupo que consiste en Holstein, Friesian y razas cruzadas Holstein-Friesian, Friesian británica y/o holandesa.

10. Uso del método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para realizar la selección asistida por marcador o selección genómica para fertilidad aumentada en dicho bovino. 35

Figura 1

Figura 2