Un polipéptido de hemolisina alfa recombinante de Staphylococcus aureus, que tiene una deleción en el dominio del tallo y secuencias heterólogas insertadas.

Un polipéptido de hemolisina alfa monocatenario recombinante de Staphylococcus aureus,

que tiene una deleción en el dominio del tallo para eliminar la actividad hemolítica, caracterizado por que se inserta al menos una secuencia heteróloga en una región seleccionada del grupo que consiste en regiones definidas por la posición de aminoácidos 108 a 151, posición de aminoácidos 1 a 5, posición de aminoácidos 288 a 293, posición de aminoácidos 43 a 48, posición de aminoácidos 235 a 240, posición de aminoácidos 92 a 97, posición de aminoácidos 31 a 36, posición de aminoácidos 156 a 161 con respecto a la secuencia de tipo silvestre SEC ID Nº: 1, a condición de que, si la secuencia heteróloga contiene cinco o más restos de histidina consecutivos, el grupo de la secuencia heteróloga distinto del grupo representado por dichos cinco o más restos de histidina consecutivos tiene una longitud mínima de 11 restos de aminoácido; o una variante del mismo, en el que además de dicha deleción en el dominio del tallo y dicha inserción de secuencia heteróloga, se añaden, sustituyen o suprimen de 1 a 50 restos de aminoácido con respecto a la secuencia de tipo silvestre SEC ID Nº: 1 y tiene la actividad para formar oligómeros y para unirse con bicapas lipídicas, incluyendo monocapas lipídicas y bicapas lipídicas, o membranas celulares.

Un polipéptido de hemolisina alfa recombinante de Staphylococcus aureus, que tiene una deleción en el dominio del tallo y secuencias heterólogas insertadas La invención se refiere al desarrollo de una forma modificada por ingeniería genética de hemolisina alfa bacteriana. En particular, la presente invención se refiere a un polipéptido de hemolisina alfa monocatenaria recombinante de Staphylococcus aureus, que tiene una deleción en el dominio del tallo y comprende al menos una secuencia heteróloga adicional insertada en sitios permisivos de dicho polipéptido de hemolisina alfa recombinante.

Desde el desarrollo de técnicas de ADN recombinante al final de los años 70, se ha usado tecnología de fusión génica para generar proteínas multifuncionales para una amplia serie de aplicaciones. Se utilizan proteínas de fusión en investigación científica de proteínas para diversas aplicaciones. Para construir dichas proteínas de fusión, son posibles dos tipos de conexión. Una es fusión “de extremo a extremo” en la que el extremo N terminal de un dominio se une con el extremo C terminal del otro dominio. La segunda es fusión “de inserción” en la que se inserta un dominio en fase en el medio del otro dominio parental.

Se usan proteínas o fragmentos de las mismas para activar la inmunización. La inmunización activa implica intentar estimular respuestas inmunitarias humorales y celulares administrando antígenos. Estos antígenos pueden ser formas destruidas o debilitadas de los agentes que provocan la enfermedad, subunidades de los agentes infecciosos y proteínas recombinantes correspondientes a las proteínas nativas o a poliepítopos. La inmunización pasiva implica proporcionar anticuerpos denominados gamma globulinas a alguien que se ha infectado con la enfermedad.

Un obstáculo principal en el desarrollo de vacunas es la variabilidad, complejidad y adaptabilidad de los patógenos. Por ejemplo, la variabilidad de S. aureus está asociada con sus doce serotipos que se relacionan con la composición de polisacáridos capsulares. La complejidad de este microorganismo se debe a su fenotipo porque S. aureus es capaz de producir más de cuarenta factores de virulencia. La adaptabilidad se relaciona con la capacidad de la bacteria para acumular mutaciones y para volverse resistente al tratamiento con antibióticos y aún más para escapar al sistema inmunitario. Esto explica la tendencia de algunos grupos farmacéuticos a desarrollar vacuna multivalente combinando varios antígenos en una misma formulación de vacuna. En este contexto, una vacuna que consiste en una única proteína sería menos costosa de fabricar y tiene la ventaja de un proceso de producción práctico y ensayos de control de calidad más sencillos que una vacuna consistente en varias proteínas recombinantes.

La caracterización de epítopos es médicamente importante en aplicaciones tales como vacunación y desarrollos de anticuerpos. Inmunizar solamente con el epítopo en lugar de con el organismo completo o con el antígeno aislado tiene varias ventajas tales como la seguridad, las dificultades para obtener antígenos puros, los problemas de inmunodominancia de algunos epítopos o la posibilidad de centrar la respuesta inmunitaria en regiones proteicas que son de importancia crucial para la actividad biológica de la proteína.

Si se ha permitido que diversas técnicas de mapeo de epítopos desencadenen interacciones anticuerpos/antígeno, las posibilidades de suministrar estos epítopos de linfocitos B pequeños al sistema inmunitario son escasas. De acuerdo con la bibliografía, los enfoques clásicos que consisten simplemente en fusionar epítopos dan lugar a polipéptidos que son escasamente antigénicos. Un enfoque alternativo de vacunas de epítopos es la conjugación con un vehículo capaz de inducir una ayuda de linfocitos T eficaz para linfocitos B productores de anticuerpos. En consecuencia, es esta característica lo que limita drásticamente el uso de vacunas de epítopos obtenidas por fusión génica. De esta manera, se ha demostrado que las partículas de tipo virus son armazones moleculares adecuados de epítopos de linfocitos B. Sin embargo este enfoque se enfrenta con frecuencia al “problema de ensamblaje” que se produce cuando la fusión o inserción de epítopos evita el ensamblaje de la proteína del núcleo para formar la partícula de tipo virus.

La mayoría de las cepas de Staphylococcus aureus secretan hemolisina alfa (HA) estafilocócica como un monómero soluble en agua de un polipéptido de 293 restos. Esta toxina forma poros heptaméricos en membranas de células susceptibles tales como plaquetas, eritrocitos, monocitos de sangre periférica, macrófagos, queratinocitos, fibroblastos y células endoteliales. La HA está dotada de propiedades hemolíticas, citotóxicas, demonecróticas y letales tanto de seres humanos como de animales. También se ha indicado un papel de esta toxina en la formación de biopelículas de Staphylococcus aureus y más concretamente en interacciones célula a célula. La estructura cristalina del heptámero HA en detergente indica un objeto con forma de seta en la que la mitad inferior del tallo (K110 a Y148) , un barril β de 14 cadenas, forma un canal transmembrana compuesto de restos de las siete regiones ricas en glicina centrales de las cadenas polipeptídicas (Figura 1) . El tercio N y C terminal del polipéptido se organiza en una estructura de tipo sándwich β que participa en la formación del sombrero de la seta localizada fuera de la célula diana.

Staphylococcus aureus es una bacteria Gram positiva, resistente, que es causa frecuente de enfermedad tanto adquirida en comunidad como nosocomial. La colonización asintomática transitoria es habitual, apareciendo en hasta el 40 % de niños y adultos. En una minoría de casos, la infección por S. aureus se asocia con enfermedad grave, incluyendo bacteriana, osteomielitis, endocarditis, meningitis y formación de abscesos. Las infecciones por S.

aureus son relativamente difíciles de tratar, y pueden producirse enfermedades invasivas y recaída después del tratamiento con antibióticos.

Las infecciones provocadas por S. aureus también son problemáticas en animales. La mastitis bovina es la enfermedad más costosa para la industria lechera en todo el mundo, con pérdidas estimadas en 2 mil millones de dólares cada año solamente en los Estados Unidos. La mastitis es la razón principal para el sacrificio, por ejemplo se ha indicado que la mastitis es la razón para el 15 % de las vacas sacrificadas en los Estados Unidos. S. aureus es una de las causas más frecuentes de mastitis bovina, y a pesar de varias décadas de investigación dirigida a combatir este patógeno, sigue siendo un problema económico sustancial para productores de leche en todo el mundo.

El tratamiento se hace más difícil por el número creciente de cepas que son resistentes a múltiples antibióticos, incluyendo meticilina. También se ha desarrollado recientemente resistencia a vancomicina, un antibiótico de último recurso. La prevención de enfermedad es por lo tanto la mejor manera de limitar la morbilidad y mortalidad provocada por este organismo tanto en seres humanos como en animales. Dado que las vacunas vivas de células completas o muertas en gran medida no consiguen generar respuestas inmunitarias protectoras, se han ensayado inmunizaciones alternativas tales como:

Inmunizaciones activas:

-Los polisacáridos capsulares actúan como factores de virulencia reduciendo la capacidad de los neutrófilos polimorfonucleares hospedadores para opsonizar las bacterias. Aunque se han identificado 12 polisacáridos capsulares de S. aureus, los tipos 5 y 8 han explicado históricamente la mayoría de las enfermedades de S. aureus. Se desarrolla una vacuna que contiene polisacáridos del tipo 5 y 8 (StaphVAX, Nabi Biopharmaceuticals) . Su capacidad protectora se ha demostrado en un modelo de ratón. También se ha mostrado que son seguros e inmunogénicos en seres humanos. Aunque es la única vacuna estafilocócica hasta la fecha que se ha ensayado en un ensayo clínico de Fase III, no ha conseguido cumplir los objetivos de estos ensayos clínicos de Fase III.

-Se ha mostrado que la inmunización con poli N-acetilglucosamina, un carbohidrato de superficie de S. aureus sintetizado por productos de icaABC, protege a los ratones contra enfermedad estafilocócica.

-Las vacunas subunitarias compuestas de proteínas de superficie individuales, por ejemplo, factor de aglutinación A (ClfA) , factor de aglutinación B (ClfB) , determinante de superficie regulado por hierro B (IsdB) , o proteína de unión a fibronectina (FnBP) , generan respuestas inmunitarias que proporcionan protección parcial... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido de hemolisina alfa monocatenario recombinante de Staphylococcus aureus, que tiene una deleción en el dominio del tallo para eliminar la actividad hemolítica, caracterizado por que se inserta al menos una secuencia heteróloga en una región seleccionada del grupo que consiste en regiones definidas por la posición de aminoácidos 108 a 151, posición de aminoácidos 1 a 5, posición de aminoácidos 288 a 293, posición de aminoácidos 43 a 48, posición de aminoácidos 235 a 240, posición de aminoácidos 92 a 97, posición de aminoácidos 31 a 36, posición de aminoácidos 156 a 161 con respecto a la secuencia de tipo silvestre SEC ID Nº : 1, a condición de que, si la secuencia heteróloga contiene cinco o más restos de histidina consecutivos, el grupo de la secuencia heteróloga distinto del grupo representado por dichos cinco o más restos de histidina consecutivos tiene una longitud mínima de 11 restos de aminoácido; o una variante del mismo, en el que además de dicha deleción en el dominio del tallo y dicha inserción de secuencia heteróloga, se añaden, sustituyen o suprimen de 1 a 50 restos de aminoácido con respecto a la secuencia de tipo silvestre SEC ID Nº : 1 y tiene la actividad para formar oligómeros y para unirse con bicapas lipídicas, incluyendo monocapas lipídicas y bicapas lipídicas, o membranas celulares.

2. El polipéptido de hemolisina alfa recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia heteróloga tiene una longitud mínima de 5 restos de aminoácido, preferentemente al menos 8, 10, 12, 15, 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 300 restos de aminoácido.

3. El polipéptido de hemolisina alfa recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la secuencia heteróloga o las secuencias heterólogas deriva (n) exclusivamente de especies de Staphylococcus, preferentemente Staphylococcus aureus.

4. El polipéptido de hemolisina alfa recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la secuencia heteróloga o las secuencias heterólogas se selecciona (n) del grupo que consiste en SEB (enterotoxina B de Staphylococcus aureus) , TSST (toxina del síndrome de choque tóxico) , FnBP (proteína de unión a fibronectina) , BlaZ (β lactamasa) , ClfA (Factor de Aglutinamiento A) , PBP2a (proteína de unión a penicilina 2a) , Proteína A, todas derivadas de especies de Staphylococcus, preferentemente Staphylococcus aureus.

5. Un medicamento o una vacuna que comprenden un polipéptido de hemolisina alfa monocatenario recombinante de Staphylococcus aureus, que tiene una deleción en el dominio del tallo para eliminar la actividad hemolítica, en el que se inserta al menos una secuencia heteróloga en un bucle expuesto al disolvente del polipéptido de hemolisina alfa, en el que la secuencia heteróloga o las secuencias heterólogas se selecciona (n) de especies de Staphylococcus, preferentemente Staphylococcus aureus; o una variante del mismo, en el que además de dicha deleción en el dominio del tallo y dicha inserción de secuencia heteróloga, se añaden, sustituyen o suprimen de 1 a 50 restos de aminoácido con respecto a la secuencia de tipo silvestre SEC ID Nº : 1 y tiene la actividad para formar oligómeros y para unirse con bicapas lipídicas, incluyendo monocapas lipídicas y bicapas lipídicas, o membranas celulares.

6. El medicamento o la vacuna de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la al menos una secuencia heteróloga se inserta en una región seleccionada del grupo que consiste en regiones definidas por la posición de aminoácidos 108 a 151, posición de aminoácidos 1 a 5, posición de aminoácidos 288 a 293, posición de aminoácidos 43 a 48, posición de aminoácidos 235 a 240, posición de aminoácidos 92 a 97, posición de aminoácidos 31 a 36, posición de aminoácidos 156 a 161, preferentemente en una región definida por la posición de aminoácidos 108 a 151, con respecto a la secuencia de tipo silvestre SEC ID Nº : 1.

7. Un polipéptido de hemolisina alfa monocatenario recombinante de Staphylococcus aureus, que tiene una deleción en el dominio del tallo para eliminar la actividad hemolítica, caracterizado por que se inserta al menos una secuencia heteróloga en un sitio permisivo, y por que la secuencia heteróloga comprende un fragmento del dominio de unión a inmunoglobulina G de Proteína A de especies de Staphylococcus, preferentemente de Staphylococcus aureus; en el que dicho fragmento del dominio de unión a inmunoglobulina G de Proteína A tiene un tamaño mínimo de 5 restos de aminoácido y no tiene actividad de unión o tiene actividad de unión reducida con el dominio Fc o Fab de inmunoglobulina G en comparación con la Proteína A de longitud completa;

o una variante del mismo, en el que además de dicha deleción en el dominio del tallo y dicha inserción de secuencia heteróloga, se añaden, sustituyen o suprimen de 1 a 50 restos de aminoácido con respecto a la secuencia de tipo silvestre SEC ID Nº : 1 y tiene la actividad para formar oligómeros y para unirse con bicapas lipídicas, incluyendo monocapas lipídicas y bicapas lipídicas, o membranas celulares.

8. El polipéptido de hemolisina alfa recombinante de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el fragmento del dominio de unión a inmunoglobulina G de la Proteína A tiene una longitud de 5 a 35 restos de aminoácido, preferentemente de 5 a 30 restos de aminoácido, más preferentemente de 10 a 30 restos de aminoácido, y aún más preferentemente de 10 a 25 restos de aminoácido y/o en el que el fragmento del dominio de unión a inmunoglobulina G de la Proteína A abarca no más de dos hélices alfa completas.

9. El polipéptido de hemolisina alfa recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8, en el que el sitio

permisivo se localiza dentro de un bucle expuesto a disolvente, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en regiones definidas por la posición de aminoácidos 108 a 151, posición de aminoácidos 1 a 5, posición de aminoácidos 288 a 293, posición de aminoácidos 43 a 48, posición de aminoácidos 235 a 240, posición de aminoácidos 92 a 97, posición de aminoácidos 31 a 36, posición de aminoácidos 156 a 161 con respecto a la secuencia de tipo silvestre SEC ID Nº : 1.

10. El polipéptido de hemolisina alfa recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el dominio del tallo se encuentra dentro de la secuencia de aminoácidos de Thr109 a Gln150 con respecto a la secuencia de tipo silvestre SEC ID Nº : 1 y se retira parcial o completamente.

11. El polipéptido de hemolisina alfa recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el resto de hemolisina alfa tiene las secuencias SEC ID Nº : 3 (ICHA I) o SEC ID Nº : 5 (ICHA II) , o variantes de las mismas en el que el resto de hemolisina alfa tiene un 85 %, preferentemente un 90 %, más preferentemente un 95 % o más identidad de aminoácidos con respecto a las secuencias SEC ID Nº : 3 o SEC ID Nº : 5.

12. Un polinucleótido que codifica el polipéptido de hemolisina alfa recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Un vector que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 12. 20

14. Un transformante que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 12 o el vector de acuerdo con la reivindicación 13.

15. Un medicamento o una vacuna que comprenden un polipéptido de hemolisina alfa monocatenario recombinante

de Staphylococcus aureus, que tiene una deleción en el dominio del tallo para eliminar la actividad hemolítica, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado por que se inserta al menos una secuencia heteróloga en un sitio permisivo, y por que la secuencia heteróloga comprende un fragmento del dominio de unión a inmunoglobulina G de la Proteína A de especies de Staphylococcus, preferentemente de Staphylococcus aureus; en el que dicho fragmento del dominio de unión a inmunoglobulina G de la Proteína A tiene un tamaño mínimo de 5

restos de aminoácidos y no tiene actividad de unión o tiene actividad de unión reducida con el dominio Fc o Fab de inmunoglobulina G en comparación con la Proteína A de longitud completa;

o una variante del mismo, en el que además de dicha deleción en el dominio del tallo y dicha inserción de secuencia heteróloga, se añaden, sustituyen o suprimen de 1 a 50 restos de aminoácido con respecto a la secuencia de tipo silvestre SEC ID Nº : 1 y tiene la actividad para formar oligómeros y para unirse con bicapas lipídicas, incluyendo monocapas lipídicas y bicapas lipídicas, o membranas celulares.