Doble musculación en mamíferos.

Un kit de diagnóstico, para determinar el genotipo de una muestra de material genético de mamífero,

comprendiendo el kit:

un par de cebadores, en donde un primero de los cebadores incluye una secuencia nucleotídica de suficiente longitud y suficientemente complementaria a una mutación de la SEC ID Nº 1 y que se une en condiciones de alta rigurosidad a una secuencia de ácido nucleico que contiene dicha mutación, seleccionándose la mutación entre el grupo de mutaciones resultantes de:

(a) deleción de 11 nucleótidos empezando en el nucleótido 821 de la parte codificante de la SEC ID Nº 1;

(b) deleción de 7 nucleótidos empezando en el nucleótido 419 de la secuencia codificante e inserción de la secuencia AAGCATACAA en su lugar;

(c) deleción del nucleótido 610 de la secuencia codificante e inserción de T en su lugar;

(d) deleción del nucleótido 676 de la secuencia codificante e inserción de T en su lugar; y

(e) combinaciones de las mutaciones (a) a (d).

Doble musculación en mamíferos

Campo de la invención La presente invención se refiere a factores que afectan al desarrollo muscular en mamíferos, especialmente ganado. En particular, la presente invención se refiere a la clonación de un procedimiento para determinar genotipos de miostatina.

Descripción de la técnica relacionada La superfamilia de TGF-β consiste en un grupo de polipéptidos multifuncionales que controlan un amplio intervalo de procesos de diferenciación en muchos tipos celulares de mamífero. GDF-8 es un miembro de la superfamilia de TGF-β. Todos los miembros de esta superfamilia comparte una estructura común que incluye una corta señal peptídica para la secreción y un fragmento peptídico N-terminal que se separa del fragmento carboxi-terminal bioactivo por escisión proteolítica en un sitio de escisión proteolítica altamente conservado. El dominio carboxiterminal bioactivo se caracteriza por restos de cisteína en posiciones altamente conservadas que están implicados en puentes disulfuro intra-e intermoleculares. Las moléculas funcionales son dímeros covalentemente unidos (mediante un enlace S-S) del dominio carboxi-terminal (Masterson y col., 1996) .

Recientemente, se informó de que ratones deficientes en el gen que codifica GDF-8 se caracterizaban por una hiperplasia muscular generalizada (McPherron y col., 1997) . Los ratones GDF-8 deficientes se produjeron por direccionamiento génico usando recombinación homóloga en células madre embrionarias, un procedimiento mencionado como "desactivación génica". La hiperplasia muscular generalizada murina pareció ser muy similar en su expresión a la hiperplasia muscular que caracteriza al ganado bovino de "doble musculación". Esta observación planteó la intrigante posibilidad de que el gen bovino que codifica GDF-8 (es decir, el homólogo evolutivo bovino del gen de GDF-8 de ratón) esté implicado en el fenotipo bovino de doble musculación. También planteó la posibilidad de que el gen humano que codifica GDF-8 (es decir, el homólogo evolutivo humano del gen de GDF-8 de ratón) esté implicado en la regulación del desarrollo muscular en seres humanos, específicamente la génesis del músculo esquelético. El aislamiento del gen de GDF-8 humano puede tener usos/aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de enfermedades musculodegenerativas a través de la regulación positiva o regulación negativa de la expresión de GDF-8.

Se ha informado de la existencia de animales caracterizados por una hipertrofia muscular generalizada distinta, habitualmente conocidos como animales de "doble musculación", en varias razas de ganado bovino en todo el mundo. La primera descripción documentada de ganado bovino de doble musculación data de tan pronto como 1807 (Culley, 1807) . Una de las razas en que esta característica ha sido más minuciosamente estudiada es la raza Azul Belga de ganado bovino ("raza Azul Belga") . Ésta es una de las pocas razas en las que se ha seleccionado sistemáticamente el rasgo de doble musculación, y en las que el fenotipo de doble musculación es casi fijo. Una comparación de animales de doble musculación y convencional dentro de la raza Azul Belga, mostró un aumento en la masa muscular del 20% de promedio, mientras que todos los demás órganos estaban reducidos en tamaño (Hanset, 1986 y 1991) . Se demostró que la hipertrofia muscular era una hiperplasia histológica que afectaba principalmente a músculos superficiales, acompañada por una reducción del 50% en el contenido total de lípidos y

una reducción en la fracción de tejido conectivo medida por contenido de hidroxiprolina (Hanset y col., 1982) . Los animales de doble musculación demostraron tener una ingesta reducida de pienso con tasa mejorada de conversión del pienso (Hanset y col., 1987) . Un importante beneficio económico de los animales de doble musculación, en contraste con los animales convencionales, es el aumento sustancial en el precio de venta y los ingresos netos para el ganadero (Hanset y col., 1987) .

Una de las series de estudios más minuciosos sobre musculación doble es la de Hanset y colaboradores en la raza Azul Belga. Se midieron los criterios objetivos de desarrollo muscular, tales como porcentaje de desollamiento, el porcentaje de magro y grasa, las concentraciones de creatina y creatinina en plasma y glóbulos rojos, en casi 150 animales seleccionados aleatoriamente criados en condiciones normalizadas. Estos estudios revelaron claramente 55 distribuciones bimodales anormales del fenotipo de doble musculación y confirmaron objetivamente la clasificación visual tradicionalmente realizada por los criadores sobre animales de doble musculación y convencionales. La distribución fenotípica se resolvió usando un procedimiento de probabilidad máxima en dos poblaciones normales componentes con una varianza común que reveló diferencias en la media de tres a cuatro desviaciones típicas dependiendo del rasgo. Esto sugirió la presencia de un alelo que tenía un efecto principal sobre el desarrollo muscular con una frecuencia de población cercana al 50% (Hanset y Michaux, 1985b) . La evidencia más convincente a favor de dicho alelo, sin embargo, proviene de cruces experimentales que implican toros Azul Belga de doble musculación y vacas lecheras Holstein Friesian (teniendo los últimos animales un desarrollo muscular muy pobre) . Aunque la descendencia F1 mostró una distribución fenotípica muy similar a sus hembras Holstein Friesian, el retrocruzamiento de estos F1 con toros de doble musculación produjo una generación BC bimodal, que apunta 65 claramente hacia una segregación mendeliana de un alelo "mh" (hipertrofia muscular) recesivo (Hanset y Michaux., 1985a) .

Posteriormente se usó el mismo tipo de cruces experimentales para realizar una exploración de genoma completo usando un mapa de marcadores basado en microsatélites. Para realizar el análisis de vinculación, los animales se clasificaron como de doble musculación o convencionales. Se obtuvieron valores muy significativos del logaritmo de la probabilidad (valores lod) en el cromosoma 2 (> 17) , y un análisis de vinculación de múltiples puntos posicionó el

locus mh en el extremo centromérico de este cromosoma, a [2]centimorgan del marcador más cercano de microsatélite: TGLA44. La región cromosómica correspondiente justificó toda la varianza del rasgo asumido como completamente penetrante en este experimento (Charlier y col., 1995) .

En seres humanos, se han aislado los genes que codifican algunas formas de anormalidades musculares, por ejemplo distrofia muscular. La divulgación proporciona el gen que regula el desarrollo del músculo esquelético solamente, en oposición a otros tipos de músculo, por ejemplo músculo liso o cardiaco. La divulgación puede proporcionar una comprensión del papel del gen de GDF-8 o su receptor en el recrecimiento de músculo esquelético en seres humanos que solamente experimentan una respuesta hiperplásica.

Sumario de la invención Los presentes inventores han identificado y secuenciado un gen (ADNc y genómico) que codifica una proteína miostatina bovina. La secuencia codificante de ácido nucleico se identifica como SEC ID Nº 1 y la secuencia proteica se identifica como SEC ID Nº 2. La secuencia i bovina genómica se identifica como SEC ID Nº 54. Se ha secuenciado un gen mutante (SEC ID Nº 3) en que la secuencia codificante carece de una secuencia consecutiva de 11 pares de bases (SEC ID Nº 11) de la secuencia que codifica la proteína bovina que tiene actividad miostatina. Se ha demostrado que ganado bovino de la raza Azul Belga homocigóticos para el gen mutante que carece de actividad miostatina son de doble musculación. También se han determinado otras mutaciones bovinas que conducen a doble musculación, identificándose en el presente documento como nt419 (del7-ins10) , Q204X, E226X y C313Y,

respectivamente. En un aspecto, como se define en las reivindicaciones, la presente invención por tanto proporciona un procedimiento para determinar la presencia de hiperplasia muscular en un mamífero. El procedimiento incluye obtener una muestra de material que contiene ADN del mamífero y averiguar si está presente una secuencia del ADN que codifica (a) una proteína que tiene actividad biológica de miostatina, y si está presente una secuencia del ADN que codifica (b) una proteína alélica que carece de la actividad de (a) . La ausencia de (a) y la presencia de (b) indican la presencia de hiperplasia muscular en el mamífero.

Por supuesto, la mutación responsable de la ausencia de actividad puede ser una mutación de origen natural, como es el caso para las razas Azul Belga, Asturiana, Parthenaise o Rubia Gallega, aquí mostradas.

El mamífero puede ser un bovino,... [Seguir leyendo]

1. Un kit de diagnóstico, para determinar el genotipo de una muestra de material genético de mamífero, comprendiendo el kit:

un par de cebadores, en donde un primero de los cebadores incluye una secuencia nucleotídica de suficiente longitud y suficientemente complementaria a una mutación de la SEC ID Nº 1 y que se une en condiciones de alta rigurosidad a una secuencia de ácido nucleico que contiene dicha mutación, seleccionándose la mutación entre el grupo de mutaciones resultantes de:

(a) deleción de 11 nucleótidos empezando en el nucleótido 821 de la parte codificante de la SEC ID Nº 1;

(b) deleción de 7 nucleótidos empezando en el nucleótido 419 de la secuencia codificante e inserción de la secuencia AAGCATACAA en su lugar;

(c) deleción del nucleótido 610 de la secuencia codificante e inserción de T en su lugar;

(d) deleción del nucleótido 676 de la secuencia codificante e inserción de T en su lugar; y

(e) combinaciones de las mutaciones (a) a (d) .

2. El kit de diagnóstico de la reivindicación 1 en el que un segundo del par de cebadores está localizado completamente cadena arriba o completamente cadena abajo de la mutación o de las mutaciones seleccionadas.

3. El kit de diagnóstico de la reivindicación 2 en el que un dicho primer cebador abarca la mutación (a) y que comprende adicionalmente un tercer cebador que es suficientemente complementario a la secuencia nucleotídica identificada como SEC ID Nº 11 para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que contiene la SEC ID Nº 11.

4. El kit de diagnóstico de la reivindicación 2 en el que un dicho primer cebador es suficientemente complementario a la secuencia insertada de la mutación (b) para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que contiene la mutación (b) y que comprende adicionalmente un tercer cebador que es suficientemente complementario a la secuencia correspondiente a la deleción de 7 nucleótidos de la mutación (b) para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que contiene la deleción de 7 nucleótidos de la mutación (b) .

5. El kit de diagnóstico de la reivindicación 2 en el que un dicho primer cebador abarca la mutación (c) y que comprende adicionalmente un tercer cebador que es suficientemente complementario a la secuencia que abarca la región correspondiente que carece de la mutación (c) para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que carece de la mutación (c) .

6. El kit de diagnóstico de la reivindicación 2 en el que un dicho primer cebador abarca la mutación (d) y que comprende adicionalmente un tercer cebador que es suficientemente complementario a la secuencia que abarca la región correspondiente que carece de la mutación (d) para cebar la amplificación de una molécula de ácido nucleico que carece de la mutación (d) .

7. Un procedimiento para determinar la presencia de hiperplasia muscular en un animal bovino, comprendiendo el procedimiento:

averiguar si está presente ADN que tiene una mutación definida en la reivindicación 1 en una muestra de material que contiene ADN de dicho animal usando cebadores definidos en la reivindicación 1 o una sonda de longitud suficiente y suficientemente complementaria a una molécula de ácido nucleico que contiene dicha mutación y que se une en condiciones de alta rigurosidad a una secuencia de ácido nucleico que contiene dicha mutación; y averiguar si está presente ADN que tiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene actividad biológica de miostatina, en donde la ausencia de ADN que tiene dicha secuencia nucleotídica y la presencia de dicha mutación indican la presencia de hiperplasia muscular en el animal.

8. El procedimiento de la reivindicación 7 en el que el animal es una raza seleccionada entre Azul Belga, Asturiana, Parthenaise y Rubia Gallega.