CEBADORES UNIVERSALES Y SU UTILIZACION PARA LA DETECCION Y LA IDENTIFICACION DE VEGETALES EN UNAS MEZCLAS COMPLEJAS.

Par de oligonucleótidos, caracterizado porque el primer oligonucleótido se híbrida a la secuencia de la SEC ID nº 68 y el segundo oligonucleótido se híbrida a la secuencia de la SEC ID nº 69,

en unas condiciones de astringencia suficientes para la amplificación selectiva de una región variable del intrón del gen cloroplástico trnL del tabaco cuya secuencia está representada en la SEC ID nº 3

Cebadores universales y su utilización para la detección y la identificación de vegetales en unas mezclas complejas.

La presente invención se refiere a unos oligonucleótidos y a su utilización como cebadores universales para la detección y la identificación de especies vegetales, en particular en unos sustratos complejos o degradados.

Se conocen diferentes métodos que permiten la identificación de vegetales basados en el análisis del genoma, pero ninguno permite por ahora trabajar sobre unos sustratos degradados y/o complejos.

Los métodos de huellas genéticas se basan así en el análisis del genoma completo. El objetivo de estos métodos es proporcionar una huella genética propia de cada individuo (identificación del individuo y no de la especie). Sin embargo, a pesar de que no es el objetivo inicial, pueden permitir asimismo en una cierta medida la identificación de la especie. Todos estos métodos necesitan la obtención de ADN de buena calidad (no degradado) y sin mezcla con unos ADN exógenos (que proceden de otros organismos). Por esta razón, es imposible utilizar estos enfoques para la identificación de vegetales en unos sustratos degradados o complejos.

A título de ejemplo de método de huella genética, se pueden citar los métodos AFLP y DArT.

El método AFLP "Amplified Fragment Length Polymorphism" es actualmente muy utilizado al mismo tiempo en genética de las poblaciones y en cartografía genética (Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, Zabeau M (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23, 4407-4414; patente US nº 6.045.994). Se basa en una digestión/ligación del ADN genómico, seguida de dos amplificaciones sucesivas que utilizan unos cebadores PCR particulares de manera que se simplifica el genoma para hacerlo analizable mediante electroforesis. Necesita ADN de muy buena calidad, y en cantidad suficiente (varias centenas de nanogramos de ADN en general). Es absolutamente imposible utilizar este enfoque de manera pertinente para el análisis de sustratos degradados y complejos.

El método DArT "Diversity Array Technology" se basa en un enfoque muy similar (digestión/ligación y después amplificación), pero difiere por el método de análisis (hibridación) (Jaccoud D, Peng K, Feinstein D, Kilian A (2001) Diversity arrays: a solid state technology for sequence information independent genotyping. Nucleic Acids Research, 29, e25; patente US nº 6.713.258). Es posible asimismo utilizar este enfoque sobre unos sustratos degradados y complejos.

Otros métodos se basan en la amplificación y en la secuenciación. Desde un punto de vista teórico, la secuenciación de una región homologa suficientemente larga (varios centenares de pares de bases) posee el potencial para permitir la identificación de la especie en los vegetales. Dicha región debe estar encuadrada por unas zonas muy conservadas que permiten la concepción de cebadores universales para la amplificación. El ADN nuclear no es muy apropiado, debido a que su acceso es muy difícil, incluso imposible, en el caso de sustratos degradados. Sin embargo, en lo que se refiere al ADN nuclear, los ITS (Internal Transcripted Spacer del ADN ribosómico) han sido utilizados para la detección y la identificación de vegetales. Unos cebadores universales han sido descritos en los hongos y ha resultado que funcionan asimismo en los vegetales (White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J (1990) Amplificaron and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, en: PCR protocols, a guide to methods and applications (eds. Innis MA, Gelfand DH, Sninski JJ, White TJ), p. 315-322. Academic Press, San Diego, California). Por eso, esta región de algunos centenares de pares de bases ha sido utilizada para efectuar unas filogenias entre especies parecidas en los vegetales (Baldwin BG (1992) Phylogenetic utility of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: an example from the Compositae. Molecular Phylogenetics and Evolution, 1, 3-16; Gielly L, Yuan Y-M, Küpfer P, Taberlet P (1996) Phylogenetic use of noncoding regions in the genus Gentiana L.: chloroplast trnL (UAA) intron versus nuclear ribosomal internal transcribed spacer sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution, 6, 460-466) y para identificar las especies (véase por ejemplo Linder C, Moore L, Jackson R (2000) A universal molecular method for identifying underground plant parts to species. Molecular Ecology, 9,1549-1559 o la página web de la compañía "Bioprofiles": http://www.bioprofiles.co.uk/). Sin embargo, esta región adolece de ciertos inconvenientes. En primer lugar, es demasiado larga para ser utilizada en el caso de sustratos muy degradados, además se trata de secuencias nucleares ciertamente repetidas, pero en menor medida que las presentes en el ADN cloroplástico. En segundo lugar, los cebadores pueden amplificar varios tipos de secuencia en el seno de una misma especie. Por último, los cebadores no son realmente universales y puede ser difícil obtener una amplificación en ciertas especies.

Por el contrario, los ADN mitocondrial y cloroplástico están presentes repetidos en gran medida en cada célula (varios centenares de copias). Resulta de ello que representan una diana para la amplificación mucho más accesible en el caso de sustratos degradados. El ADN mitocondrial es sin embargo muy poco variable en los vegetales.

Así, varios artículos describen unos cebadores universales dirigidos a diferentes regiones del ADN cloroplástico (Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991) Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105-1109; Demesure B, Sodzi N, Petit RJ (1995) A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants. Molecular Ecology, 4, 129-131; Dumolin-Lapégue S, Pemonge M-H, Petit RJ (1996) An enlarged set of consensus primers for the study of organelle DNA in plants. Molecular Ecology, 5, 393-397; y Hamilton MB (1999) Four primer pairs for the amplification of chloroplast intergenic regions with intraspecific variation. Molecular Ecology, 8, 521-523). Algunas de ellas han sido ampliamente utilizadas para amplificar y secuenciar unas regiones variables del ADN cloroplástico. Se trata principalmente de los cebadores c y d (Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991) Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105-1109) que amplifican el intrón del gen del ARN de transferencia para la leucina, codón UAA (trnL UAA). Actualmente, varios millares de secuencias de este intrón están disponibles en las bases de datos públicas (GenBank). El intrón del gen trnL (UAA) es muy variable, pero posee asimismo unas partes conservadas, lo que se relaciona con el hecho de que puede constituir unas estructuras secundarias (Simón D, Fewer D, Friedl T, Bhattacharya D (2003) Phylogeny and self-splicing ability of the plastid tRNA-Leu group I intron. Journal of Molecular Evolution, 57, 710-720). Sin embargo, estos cebadores c y d amplifican unas regiones hbox{demasiado largas para ser utilizadas sobre unos sustratos degradados.}

Otra solución para la identificación específica ha sido propuesta por Bobowski et al. (Bobowski B, Hole D, Wolf P, Bryant L (1999) Identification of roots of woody species using polymerase chain reaction (PCR) and restricted fragment length polymorphism (RFLP) analysis. Molecular Ecology, 8, 485-491): amplificación del gen rbcL con la ayuda de cebadores universales, y caracterización del producto de amplificación mediante digestión enzimática seguida de una migración sobre gel (el producto podría ser asimismo caracterizado mediante secuenciación directa).

Sin embargo, todos estos cebadores amplifican unas regiones demasiado largas para ser utilizadas sobre unos sustratos degradados. Es la razón por la que otros cebadores han sido definidos por Poinar et al. (Poinar HN, Hofreiter M, Spaulding WG, Martin PS, Stankiewicz BA, Bland H, Evershed RP, Possnert G, Pääbo S (1998) Molecular coproscopy: Dung and diet of the extinct ground sloth Nothrotheriops shastensis. Science, 281, 402-406) con el fin de amplificar unos fragmentos más cortos, compatibles con el análisis de restos "fósiles" (coprolitos de un perezoso desaparecido en este caso). Estos autores han concebido unos cebadores en el gen cloroplástico rbcL. Los fragmentos amplificados permiten justo identificar la familia, y estos cebadores no son realmente universales. A pesar de ello,...

1. Par de oligonucleótidos, caracterizado porque el primer oligonucleótido se híbrida a la secuencia de la SEC ID nº 68 y el segundo oligonucleótido se híbrida a la secuencia de la SEC ID nº 69, en unas condiciones de astringencia suficientes para la amplificación selectiva de una región variable del intrón del gen cloroplástico trnL del tabaco cuya secuencia está representada en la SEC ID nº 3.

2. Par de oligonucleótidos, caracterizado porque el primer oligonucleótido se híbrida a la secuencia de la SEC ID nº 68 y el segundo oligonucleótido se híbrida a la secuencia de la SEC ID nº 69, en unas condiciones de astringencia suficientes para la amplificación selectiva de una región variable del intrón del gen cloroplástico trnL de los vegetales cuya secuencia está representada en las SEC ID nº 24 a nº 67.

3. Par de oligonucleótidos según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la hibridación se efectúa a 55ºC en un tampón de amplificación que comprende MgCl₂ 2 mM.

4. Par de oligonucleótidos según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el primer oligonucleótido se selecciona de entre el grupo constituido por las SEC ID nº 1, nº 4 a nº 15, y el segundo oligonucleótido se selecciona de entre el grupo constituido por las SEC ID nº 2, nº 16 a nº 23.

5. Oligonucleótido, caracterizado porque su secuencia se selecciona de entre el grupo constituido por la SEC ID nº 1, la SEC ID nº 2, las SEC ID nº 4 a nº 15 y las SEC ID nº 16 a nº 23.

6. Polinucleótido, caracterizado porque su secuencia se selecciona de entre el grupo constituido por las SEC ID nº 24 a nº 67.

7. Par de oligonucleótidos según una de las reivindicaciones 1 a 4, oligonucleótido según la reivindicación 5 o polinucleótido según la reivindicación 6, caracterizados porque se inmovilizan sobre un soporte sólido.

8. Procedimiento de amplificación de una región variable del ADN cloroplástico de los vegetales, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

9. Procedimiento de amplificación de una región variable del ADN cloroplástico de los vegetales según la reivindicación 8, caracterizado porque en la etapa b) la región variable del ADN cloroplástico amplificada es un polinucleótido cuya secuencia se selecciona de entre el grupo constituido por las SEC ID nº 24 a nº 67.

10. Procedimiento de detección de una especie vegetal en una muestra, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

11. Procedimiento de detección de una especie vegetal en una muestra según la reivindicación 10, caracterizado porque en la etapa c) el producto de amplificación es un polinucleótido cuya secuencia se selecciona de entre el grupo constituido por las SEC ID nº 24 a nº 67.

12. Procedimiento de identificación de una especie vegetal en una muestra, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

13. Procedimiento de identificación de una especie vegetal en una muestra según la reivindicación 12, en el que en la etapa c) el producto de amplificación es un polinucleótido cuya secuencia se selecciona de entre el grupo constituido por las SEC ID nº 24 a nº 67.

14. Procedimiento de identificación de una especie vegetal en una muestra según la reivindicación 12 ó 13, en el que en la etapa c) se determina la secuencia del producto de amplificación para identificar la especie vegetal contenida en la muestra.

15. Procedimiento de identificación de una especie vegetal en una muestra según la reivindicación 12 ó 13, en el que en la etapa c) se hibrida el producto de amplificación con por lo menos una secuencia vegetal de referencia para identificar la especie vegetal contenida en la muestra.

16. Procedimiento de identificación de una especie vegetal en una muestra según la reivindicación 15, en el que la secuencia de referencia se selecciona de entre el grupo constituido por las SEC ID nº 3 y nº 24 a nº 67.

17. Procedimiento de identificación de una especie vegetal en una muestra según la reivindicación 12 ó 13, en el que en la etapa c) se analiza el producto de amplificación mediante electroforesis para identificar la especie vegetal contenida en la muestra.

18. Utilización de la región variable del intrón del gen cloroplástico trnL de los vegetales que corresponde a las posiciones 49425 a 49466 del ADN cloroplástico del tabaco para la detección y la identificación de especies vegetales.

19. Utilización según la reivindicación 18, en la que la región variable del intrón del gen cloroplástico trnL de los vegetales es un polinucleótido cuya secuencia se selecciona de entre el grupo constituido por las SEC ID nº 24 a nº 67.