ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-CD71 Y SUS UTILIZACIONES PARA EL TRATAMIENTO DE LAS CELULAS TUMORALES MALIGNAS.

Anticuerpo monoclonal anti-CD71, o fragmento de unión al antígeno del mismo,

que comprende por lo menos una región variable que comprende por lo menos una cadena pesada de SEC ID nº 1 y por lo menos una cadena ligera de SEC ID nº 2

Anticuerpos monoclonales anti-CD71 y sus utilizaciones para el tratamiento de las células tumorales malignas.

La presente invención proporciona nuevos anticuerpos monoclonales anti-CD71, particularmente anticuerpos monoclonales anti-CD71 híbridos ratón-humano, ventajosamente asociados a las células efectoras para desencadenar mecanismos de ADCC. Los anticuerpos anti-CD71, así como las composiciones farmacéuticas que los contienen, resultan útiles para inhibir la proliferación y/o destruir las células tumorales malignas, especialmente las células de melanoma uveal y cutáneo metastásico.

Los anticuerpos monoclonales pueden influir en la supervivencia celular tumoral mediante varios mecanismos, que actúan directamente sobre las células diana tumorales y/o mediante la activación de los mecanismos efectores mediados por las células o factores solubles. Originariamente, el anticuerpo era de origen múrido y, cuando es administrado a humanos, indujo respuestas inmunitarias fuertes a la inmunoglobulina de ratón extraña. Esto limitó su utilización. La ingeniería genética ha permitido el desarrollo de los anticuerpos denominados humanizados con eficacia terapéutica incrementada.

Los anticuerpos híbridos son secuencias de nucleótidos 65-90% humanas y están constituidos por las regiones variables múridas, que provocan el reconocimiento del antígeno, fusionadas a la parte efectora o constante de un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanizados son aproximadamente 95% humanos, y están realizados injertando únicamente la región hipervariable, o las regiones determinantes de complementariedad, del anticuerpo múrido -que determina la especificidad del anticuerpo- sobre un esqueleto de anticuerpo humano. Los desarrollos de los ratones transgénicos de ingeniería genética y los avances en la generación de bibliotecas de anticuerpos humanos sintéticos han posibilitado la producción de los anticuerpos totalmente humanos en una escala comercial.

Los anticuerpos híbridos, humanizados y completamente humanos presentan una inmunogenia inferior que los constructos de anticuerpos anteriores y permiten la administración de anticuerpos repetida, una capacidad mejorada para captar células citotóxicas y complemento, y una estabilidad potenciada en el sistema circulatorio. Esta mejora ha contribuido a la eficacia terapéutica aumentada de los anticuerpos monoclonales. Los fragmentos de anticuerpo pequeños se han sometido asimismo a ingeniería para mejorar la penetración de los anticuerpos en los tumores avasculares grandes, especialmente los tumores sólidos. Una región fija variable monocatenaria (Fv) está constituida por únicamente un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, que están unidos covalentemente mediante un enlace peptídico corto. Estos fragmentos pueden ser utilizados para suministrar radioisótopos o fármacos en los sitios tumorales. Los anticuerpos han sido asimismo concebidos para presentar dos brazos de unión de antígeno diferentes y presentan así especificidad de unión doble. Un ejemplo es cuando un brazo se une a la célula tumoral y el otro se une a la célula efectora. Otro ejemplo es cuando los brazos no se unen únicamente a dos antígenos diferentes en la célula tumoral, sino además a la célula efectora mediante su fragmento Fc. Estos constructos aumentan la destrucción de las células tumorales mediada por anticuerpos mediante la captación de las células efectoras de inmunidad del huésped (linfocitos T, células asesinas naturales, y macrófagos).

Muchos antígenos que son reconocidos por los anticuerpos monoclonales son expresados no únicamente por las células malignas, sino asimismo mediante por lo menos un subconjunto de células adultas saludables. El mejor antígeno diana para una terapia de anticuerpo monoclonal (mAb) sería el expresado estable y homogéneamente por la totalidad de las células tumorales, no es muy expresado por los tejidos normales, no existe en forma soluble (para evitar el aclaramiento de anticuerpos rápido), y resulta de fácil acceso para el anticuerpo monoclonal.

Los anticuerpos no marcados provocan la muerte de las células tumorales o la interrupción de su proliferación mediante la combinación de mecanismos diferentes: 1) reclutamiento y activación de las células efectoras mediante citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), 2) bloqueo de las interacciones ligando-receptor y prevención de la actividad del factor de crecimiento, 3) inducción de la apoptosis, y 4) secreción de las citocinas.

Algunos anticuerpos no inducen la muerte celular por sí mismos y son utilizados para suministrar radioisótopos, toxinas, enzimas o fármacos a los sitios tumorales. El direccionamiento específico de los agentes citotóxicos a las células tumorales presenta el potencial de alcanzar concentraciones elevadas en los sitios tumorales, sin los efectos secundarios que limitan la dosis de la administración sistémica. En este contexto, los anticuerpos que se dirigen a los antígenos que son asimilados rápidamente ofrecen otra ventaja.

Los radioinmunoconjugados suministran selectivamente radiación a los sitios tumorales. En cuanto a los radionúclidos, se pueden utilizar, por ejemplo, I¹³¹ o Y⁹⁰, así como nuevos emisores ß (212 Pb, ß? 177 Lu mixto, 153 Sm, 186 Re, 67 Cu, 225 Ac...) o a (213 Bi, 211 At...), que utilizan ventajosamente tecnologías de quelación tales como MX-DTPA, CHX-A'' DPA, C-DOTA, PA-DOTA, DOTA-NCS (ácido 2-p-isotiocianatobencilo-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetracético). La citotoxicidad depende de la farmacocinética de la localización del anticuerpo y la retención del radionúclido. Los tejidos saludables, especialmente la médula ósea, son asimismo irradiados a causa de las energías de transmisión intensas.

Las cadenas alfa de las toxinas vegetales y bacterianas (tales como ricina, la toxina de la difteria o la toxina pseudomonas) pueden estar unidas directamente a los anticuerpos monoclonales. Tras la unión y la asimilación en la célula, estas toxinas interrumpen la síntesis proteica a bajas concentraciones. Estas toxinas provocan asimismo comúnmente respuestas inmunitarias fuertes en los humanos, lo que restringe su utilización repetida.

Los fármacos como la doxorrubicina y la caliqueaimicina pueden estar directamente unidos a los anticuerpos monoclonales. El suministro mediado por anticuerpos con caliqueamicina permite la utilización clínica de este agente muy potente, que podría de otra manera resultar demasiado tóxico para la administración sistémica por sí mismo.

Para revisiones de estos aspectos, ver M. Harris (2004), y Cancer Highlights (2004).

La CD71 es una glucoproteína de tipo II que existe como un homodímero de 180kDa, unida mediante un enlace disulfuro en la posición Cys89. Esta glucoproteína está acilada en la cisteína 62 y fosforilada en la serina 24 mediante la proteína cinasa C. Contiene una señal de asimilación constituida por un tetrapéptido YTRF (aminoácidos 20-23) (Collawn et al, 1993). Durante la división entre Arg 100 y Leu 101 mediante una proteasa todavía desconocida, la CD71 resulta insoluble. La O-glucosilación en Thr 104 reduce la sensibilidad de CD71 a la división. Los receptores de transferrina de pollo y mamífero presentan una secuencia RGD, sugiriendo una posible relación evolutiva con las moléculas de adhesión. Con respecto a la homología de la secuencia, existe una homología con la secuencia de la peptidasa estreptocócica C5a y con la secuencia de PSA (Antígeno Específico para la Próstata, que no es específico para la próstata pero que presenta una actividad dipeptidasa ácida de tipo II). La transferrina es un ligando de CD71, una proteína responsable del transporte de hierro. Recientemente, se ha demostrado que la CD71 es asimismo un receptor para la IgA (Haddad et al, 2003).

La ferrotransferrina se une a la CD71 en condiciones de pH neutro y es asimilada en el compartimiento endosómico en el que el pH es de aproximadamente 5. El hierro es liberado y es transportado en el citoplasma mediante un mecanismo desconocido. La apotransferrina permanece unida a la CD71 a pH 5 y regresa a la superficie celular en la que el pH es de aproximadamente 7,4. En condiciones de pH neutro, la apotransferrina ya no presenta afinidad por la CD71, permitiendo así el inicio de otro ciclo. Esta característica de la CD71 permite la utilización de esta superficie celular para asimilar un fármaco, una toxina o un radioelemento acoplado a un anticuerpo (Lee et al,...

1. Anticuerpo monoclonal anti-CD71, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende por lo menos una región variable que comprende por lo menos una cadena pesada de SEC ID nº 1 y por lo menos una cadena ligera de SEC ID nº 2.

2. Anticuerpo monoclonal anti-CD71, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende por lo menos una región variable que comprende por lo menos una cadena pesada codificada por SEC ID nº 3 y por lo menos una cadena ligera codificada por SEC ID nº 4.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que es producido por una línea celular de hibridoma designada BA 120 y depositada en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismos (Institut Pasteur, Paris, Francia) el 14 de junio de 2005, con el número CNCM I-3449.

4. Anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que es un anticuerpo monoclonal anti-CD71 híbrido ratón-humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo.

5. Anticuerpo híbrido según la reivindicación 4, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende además una región constante que comprende:

6. Anticuerpo híbrido según la reivindicación 4, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende además una región constante que comprende:

7. Producto de acoplamiento en el que un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 está acoplado a una molécula seleccionada de entre:

8. Producto de acoplamiento según la reivindicación 7, en el que un vector galénico es portador de dicha molécula, tal como un vector de liposoma o una emulsión catiónica.

9. Producto de acoplamiento según la reivindicación 7 u 8, que comprende un enlazador de C5 a C15 de manera que dicha molécula es liberada cuando el producto de acoplamiento es puesto en contacto con un profármaco de estearasa.

10. Composición farmacéutica que comprende por lo menos un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y un portador farmacéuticamente aceptable.

11. Composición farmacéutica que comprende por lo menos un producto de acoplamiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, y un portador farmacéuticamente aceptable.

12. Composición farmacéutica según la reivindicación 10 u 11, que comprende además células efectoras de leucocitos humanas que expresan o presentan el potencial de expresar los receptores Fc para anticuerpo y que pueden mediar la reacción de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) contra las células diana.

13. Composición farmacéutica según la reivindicación 12, en la que dichas células efectoras de leucocitos humanas son seleccionadas de entre linfocitos, monocitos, macrófagos, células NK, granulocitos, eosinófilos, y mastocitos.

14. Por lo menos una sustancia seleccionada de entre:

15. Sustancia según la reivindicación 14, en la que es utilizada en dicho procedimiento para el tratamiento del cáncer inhibiendo la proliferación y/o destruyendo las células tumorales malignas, comprendiendo dicho procedimiento proporcionar dicha sustancia a un paciente que lo requiera en las condiciones y en una cantidad suficientes para la unión de dicha sustancia a las células tumorales malignas, causando así la inhibición de la proliferación y/o la destrucción de las células tumorales malignas.

16. Sustancia según la reivindicación 15, en la que, cuando es utilizada en dicho procedimiento una composición farmacéutica según la reivindicación 12 ó 13, dichas células efectoras de leucocitos humanas son células alogénicas o autólogas de dicho paciente que requiere la inhibición de la proliferación y/o la destrucción de las células tumorales malignas.

17. Sustancia según la reivindicación 15 ó 16, en la que dichas células tumorales malignas son seleccionadas de entre células de melanoma cutáneo metastásico, melanoma uveal metastásico, glioblastoma, carcinoma de células renales, hepatocarcinoma (HCC), adenocarcinoma de ovario, adenocarcinoma pancreático, carcinoma pulmonar no microcítico (NSCLC), adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma colorrectal, malignidades hematológicas.

18. Sustancia según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en la que el nivel de transferrina intracelular y/o el nivel de hierro intracelular han sido agotados en dichas células tumorales malignas.

19. Sustancia según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en la que dicha por lo menos una sustancia puede además mejorar la respuesta inmunitaria en dicho paciente mediante la unión a los linfocitos T reguladores.

20. Molécula de ácido nucleico aislada, que comprende una o más de las secuencias nucleotídicas representadas en SEC ID nº 3 y 4.

21. Vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 20.

22. Célula huésped u organismo no humano que comprende un vector de expresión según la reivindicación 21.

23. Polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

24. Procedimiento ex vivo para agotar las células positivas a CD71 en una muestra biológica de un paciente, en el que dicha muestra biológica es probable que contenga células positivas a CD71, en el que dicho procedimiento comprende:

25. Procedimiento según la reivindicación 24, en la dicha muestra biológica es seleccionada de entre una muestra de médula ósea, sangre enriquecida en células CD34+, células troncales pluripotentes de sangre de cordón umbilical, células troncales.

26. Procedimiento según la reivindicación 24 ó 25, en el que dicho paciente ha sido trasplantado o requiere un trasplante.

27. Procedimiento según la reivindicación 24 ó 25, en el que dicho paciente presenta un cáncer.

28. Procedimiento según la reivindicación 24 ó 25, en el que dicho paciente presenta un trastorno seleccionado de entre trastornos autoinmunes y neuroinmunes.

29. Sustancia según la reivindicación 14, en la que es utilizada en dicho procedimiento para el tratamiento del cáncer mejorando la respuesta inmunitaria en un paciente que presenta un cáncer, comprendiendo dicho procedimiento proporcionar dicha sustancia a dicho paciente en condiciones y en una cantidad suficientes para la unión de dicha sustancia a los linfocitos T reguladores, bloqueando así la inhibición de dicha respuesta inmunitaria por dichos linfocitos T reguladores.

30. Sustancia según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, 27 y 29, en la que dicho cáncer es seleccionado de entre melanomas, especialmente cutáneos y melanomas uveales, cánceres de ovario y cánceres hepáticos.