Un anticuerpo anti-VLA-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo cuyas regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera están definidas por los restos aminoacídicos 24 a 33,

49 a 55, y 88 a 96 de la SEC ID Nº 1, y cuyas regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada están definidas por los restos aminoacídicos 31 a 35, 50 a 65, y 98 a 107 de la SEC ID Nº 2

Anticuerpos contra VLA-1.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a anticuerpos contra la integrina VLA-1 y estos anticuerpos para tratar enfermedades inflamatorias y otros trastornos inmunológicos.

Esta invención describe la estructura cristalina del complejo entre uno de dichos anticuerpos y el dominio α1-I de VLA-1, y el uso de esta información estructural para el diseño computacional de fármacos.

Antecedentes de la invención

Las integrinas son una superfamilia de receptores de superficie celular que median la adhesión célula-célula y célula-matriz. Estas proteínas son conocidas por proporcionar anclaje así como señales para el crecimiento, migración y diferenciación celular durante el desarrollo y la reparación tisular. Se han implicado en procesos inmunes e inflamatorios.

Las integrinas son proteínas heterodiméricas compuestas por dos cadenas polipeptídicas unidas no covalentemente, α y β. El extremo amino d cada cadena forma una cabeza globular que contribuye a la unión intercatenaria y a la unión a ligando. Las cabezas globulares están conectadas a los segmentos transmembrana por troncos. Las colas citoplásmicas habitualmente son de menos de 50 restos aminoacídicos de longitud. Las subfamilias de integrinas se definieron originalmente en base a qué subunidad β se usaba para formar los heterodímeros. Las integrinas que contiene β1 también se llaman moléculas VLA, que se refiere a antígenos de "activación muy tardía (del inglés very late activation)". De VLA-1 a VLA-6 se refiere a miembros de la subfamilia β1 que contienen de α1 a α6 (es decir, CD49a a CD49f), respectivamente. Para una revisión general, véase Cellular and Molecular Immunology, eds. Abul K. Abbas et al., W.B. Saunders Company, Philadelphia, PA, 2000.

El colágeno (ambos tipos I y IV) y la laminina son ligandos conocidos de la integrina α1β1 (es decir, VLA-1). VLA-1 se ha implicado en la adhesión y migración celular sobre colágeno (Keely et al., 1995, J. Cell Sci. 108:595-607; y Gotwals et al., 1996, J. Clin. Invest. 97:2469-2477); en la promoción de la contracción y reorganización de matrices de colágeno, un componente crítico de la curación de heridas (Gotwals et al., supra; y Chiro, 1991, Cell 67:403-410); y en la regulación de la expresión de genes implicados en el remodelado de la matriz extracelular (Riikonen et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:1-5; y Langholz et al., 1995, J. Cell Biol. 131:1903-1915). Por tanto, la regulación inapropiada de VLA-1 puede provocar ciertas afecciones patológicas tales como fibrosis.

Además, se ha sugerido que VLA-1 puede desempeñar un papel en enfermedades dirigidas por células T/monocito. Los anticuerpos anti-VLA-1 bloquean la expresión de citoquinas dependiente de células T (Miyake et al., 1993, J. Exp. Med. 177:863-868). La expresión de VLA-1 se aumenta en células T activadas de forma persistente, de 2 a 4 semanas de edad (Hemler et al., 1985, Eur. J. Immunol. 15: 502-508). VLA-1 también se expresa en un elevado porcentaje en células T aisladas del fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (Hemler et al., 1986, J. Clin. Invest. 78:692-702).

Se han determinado varias estructuras cristalinas de subunidades α de integrina, incluyendo las estructuras del dominio α2-I de α2β1 (código de acceso a PDB laox; Emsley et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:28512-28517); el dominio α1-I de α1β1 de rata (número de acceso a PDB 1ck4; Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452:379-385; documento WO 00/20459); la subunidad α1 de α1β1 humana (código de acceso a PDB 1qc5; Rich et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:24906-24913); los dominios αL-I y αM-I; y vWF-A3 (Lee et al., 1995, Cell 80:631-635; Lee et al., 1995, Structure 3:1333-1340; Qu et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10277-10281; Qu et al., 1996, Structure 4:931-942). La estructura de α2β1 reveló una hélice (es decir, la hélice C) que creaba una zanja o surco en un lado de la proteína en el sitio de unión a iones metálicos (Emsley et al., supra). La estructura cristalina del dominio α2-I en complejo con un corto péptido triple helicoide basado en colágeno reveló que el péptido basado en colágeno se unía a esa zanja, donde los aminoácidos de α2-I que hacían los contactos intermoleculares o con el metal incluían Asp151, Asp154, Tyr157, Gln215, Asp219, Leu220, Thr221, Asp254, Glu256, His258, Tyr285, Leu286, Asn289, Leu291, Asn295, y Lys298 (código de acceso a PDB 1dzi; Emsley et al., 2000, Cell 101:47-56; documento WO 01/73444). La numeración de aminoácidos inmediatamente anterior se basa en el código de acceso a PDB 1dzi y en este documento se menciona como "numeración cristalina". Las estructuras cristalinas de los dominios α1-I de rata y humano revelaron una zanja similar.

Varias investigaciones han descrito anticuerpos anti-VLA-1. De Fougerolles et al. (J. Clin. Invest., 2000, 205:721-729) describe la importancia de las integrinas de unión a colágeno en enfermedades inflamatorias, y describe un anticuerpo monoclonal de hámster creado contra cadenas de integrina murina. Mendrick et al. (Lab. Invest., 1995, 72:367-375) describe varios anticuerpos anti-VLA-1 que reconocen VLA-1 humano y de rata. El documento US-A 5.788.966 describe dos anticuerpos anti-VLA-1, uno de los cuales reconoce VLA-1 humano y de rata. El segundo anticuerpo anti-VLA-1 no afecta a la unión de linfocitos activados a placas tratadas con colágeno IV, como se describe por Fabbri et al. (Tissue Antigens, 1996, 48:47-51). El documento JP-A 08-13118 describe un anticuerpo monoclonal capaz de reaccionar con VLA-1 murino. Fabbri et al. (loc. cit.) describen un anticuerpo monoclonal anti-VLA-1 denominado FB12. FB12 inhibe la unión de linfocitos activados a placas tratadas con colágeno. El efecto inhibidor del anticuerpo se estabiliza a aproximadamente 10 μg/ml de FB12.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a los siguientes puntos:

Punto 1. Un anticuerpo anti-VLA-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo cuyas regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera están definidas por los restos aminoacídicos 24 a 33, 49 a 55, y 88 a 96 de la SEC ID Nº 1, y cuyas regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada están definidas por los restos aminoacídicos 31 a 35, 50 a 65, y 98 a 107 de la SEC ID Nº 2.

Punto 2. El anticuerpo del punto 1, donde el anticuerpo comprende al menos uno de los siguientes restos en su cadena pesada: V12, F29, A49, T93 y R94.

Punto 3. El anticuerpo del punto 1, donde el anticuerpo comprende al menos uno de los siguientes restos en su cadena ligera: Q1, L4 e Y71.

Punto 4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo del punto 1, donde el anticuerpo comprende:

(a) una secuencia de dominio variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 1 y una secuencia de dominio variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 2; o

(b) las mismas secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera que un anticuerpo producido por el hibridoma mAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3273).

Punto 5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo del punto 1, donde el anticuerpo o fragmento es un anticuerpo humanizado.

Punto 6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo del punto 5, donde el anticuerpo o fragmento comprende:

(a) al menos uno de los siguientes restos en su cada ligera: Q1, L4, P46, W47 e Y71; o al menos uno de los siguientes restos en su cadena pesada: D1, V12, S28, F29, A49, T93, R94 (convención de numeración de Kabat); o

(b) una secuencia de dominio variable de cadena ligera definida por los restos aminoacídicos 1 a 106 de la SEC ID Nº 3, y una secuencia de dominio variable de cadena pesada definida por los restos aminoacídicos 1 a 118 de la SEC ID Nº 4; o

(c) las mismas secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera que un anticuerpo producido por la línea celular hAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3275); o

(d) las mismas secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera que un anticuerpo producido por la línea celular hsAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3356); o

(e)...

1. Un anticuerpo anti-VLA-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo cuyas regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera están definidas por los restos aminoacídicos 24 a 33, 49 a 55, y 88 a 96 de la SEC ID Nº 1, y cuyas regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada están definidas por los restos aminoacídicos 31 a 35, 50 a 65, y 98 a 107 de la SEC ID Nº 2.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, comprendiendo el anticuerpo al menos uno de los siguientes restos en su cadena pesada: V12, F29, A49, T93 y R94.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, comprendiendo el anticuerpo al menos uno de los siguientes restos en su cadena ligera: Q1, L4 e Y71.

4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, comprendiendo el anticuerpo:

(a) una secuencia de dominio variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 1 y una secuencia de dominio variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 2; o

(b) las mismas secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera que un anticuerpo producido por el hibridoma mAQC22 (número de acceso a la ATCC PTA3273).

5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, siendo el anticuerpo o fragmento un anticuerpo humanizado.

6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 5, comprendiendo el anticuerpo o fragmento:

(a) al menos uno de los siguientes restos en su cadena ligera: Q1, L4, P46, W47 e Y71; o al menos uno de los siguientes restos en su cadena pesada: D1, V12, S28, F29, A49, T93, R94 (convención de numeración de Kabat); o

(b) una secuencia de dominio variable de cadena ligera definida por los restos aminoacídicos 1 a 106 de la SEC ID Nº 3, y una secuencia de dominio variable de cadena pesada definida por los restos aminoacídicos 1 a 118 de la SEC ID Nº 4; o

(c) las mismas secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera que un anticuerpo producido por la línea celular hAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3275); o

(d) las mismas secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera que un anticuerpo producido por la línea celular hsAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3356); o

(e) las mismas secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera que un anticuerpo producido por la línea celular haAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3274).

7. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 5, en el que la cadena pesada está mutada en uno o más de los restos aminoacídicos seleccionados entre el grupo compuesto por los restos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 (sistema de numeración EU), causando de este modo una alteración en una función efectora reteniendo al mismo tiempo la unión a VLA-1 en comparación con un anticuerpo no modificado.

8. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 7, comprendiendo el anticuerpo o fragmento las mutaciones L234A y L235A (sistema de numeración EU) en su cadena pesada en comparación con un anticuerpo no modificado.

9. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 5, estando el anticuerpo o fragmento mutado en un resto aminoacídico que es un sitio de glucosilación, eliminando de este modo el sitio de glucosila-ción.

10. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 9, comprendiendo el anticuerpo o fragmento la mutación N297Q en su cadena pesada (sistema de numeración EU).

11. Una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Secuencia de ácido nucleico aislada que comprende ADN que se selecciona entre el grupo compuesto por:

(a) una secuencia codificante para la SEC ID Nº 1 y una secuencia codificante para la SEC ID Nº 2;

(b) una secuencia codificante para la cadena ligera de un anticuerpo producido por el hibridoma mAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3273) y una secuencia codificante para la cadena pesada de un anticuerpo producido por el hibridoma mAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3273);

(c) una secuencia codificante para la cadena ligera de un anticuerpo producido por la línea celular hAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3275) y una secuencia codificante para la cadena pesada de un anticuerpo producido por la línea celular hAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3275);

(d) una secuencia codificante para la cadena pesada de un anticuerpo producido por la línea celular haAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3274);

(e) una secuencia codificante para la cadena pesada de un anticuerpo producido por la línea celular hsAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3356);

(f) una secuencia codificante para los restos 1 a 106 de la SEC ID Nº 3 y una secuencia codificante para los restos 1 a 118 de la SEC ID Nº 4; y

(g) secuencias codificantes para un anticuerpo anti-VLA-1, o fragmento de unión a antígeno del mismo, cuyas regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera están definidas por los restos aminoacídicos 24 a 33, 49 a 55, y 88 a 96 de la SEC ID Nº 1, y cuyas regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada están definidas por los restos aminoacídicos 31 a 35, 50 a 65, y 98 a 107 de la SEC ID Nº 2.

13. Uso de la composición de la reivindicación 11 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno inmunológico.

14. Un método in vitro para determinar el nivel de VLA-1 en un tejido, que comprende poner en contacto el tejido con el anticuerpo de la reivindicación 1, y detectar la unión del anticuerpo al tejido, determinando de este modo el nivel de VLA-1 en el tejido.

15. Uso de la composición de la reivindicación 11 para la preparación de una composición para la determinación del nivel de VLA-1 en un tejido para su uso en el diagnóstico de un trastorno inmunológico.

16. Una célula de la línea celular hAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3275), haAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3274), hsAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3356) o del hibridoma mAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3273).

17. Un método para identificar un inhibidor de un dominio I de una integrina que comprende las etapas:

(a) usar las coordenadas estructurales de los aminoácidos de hAQC2 que comprenden los restos de cadena ligera Asn30, Tyr48, Trp90, Asn93 y Trp95, y los restos de cadena pesada Arg31, His56, Tyr58, Gly100 y Asp101, de acuerdo con la Fig. 19 o pm una desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales de dichos aminoácidos de hAQC2 de no más de 1,10 Å, para generar una estructura tridimensional de un sitio de unión;

(b) emplear dicha estructura tridimensional para diseñar o seleccionar un antagonista potencial;

(c) sintetizar dicho antagonista potencial; y

(d) poner en contacto dicho antagonista potencial con hAQC2 para determinar la capacidad de dicho antagonista potencial de interaccionar con hAQC2, donde la capacidad de dicho antagonista potencial de interaccionar con hAQC2 indica que el antagonista potencial es un inhibidor del dominio I.

18. El uso de la reivindicación 13 ó 15, en el que el trastorno inmunológico se selecciona entre el grupo compuesto por un trastorno gastrointestinal, una enfermedad autoinmune, una fibrosis, un trastorno cutáneo, una enfermedad vascular, rinitis alérgica, síndrome de distrés respiratorio, asma, bronquitis, tendinitis, bursitis, una cefalea en migrañas, periarteritis nodosa, tiroiditis, anemia aplásica, enfermedad de Hodgkin, fiebre reumática, osteoartritis, sarcoidosis, síndrome nefrótico, fallo renal, síndrome de Bechet, polimiositis, gingivitis, hipersensibilidad, rechazo de injertos o trasplantes, enfermedad de injerto contra hospedador, conjuntivitis, hinchamiento después de lesión, isquemia miocárdica, y síndrome de choque por endotoxinas.

19. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, seleccionándose el fragmento de unión a antígeno entre el grupo compuesto por un Fab, un F(ab')2 y un Fv de cadena sencilla.