ANTICUERPO PARA EL FACTOR DE CRECIMIENTO HUMANO DE TIPO INSULINICO.

Un anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo, que se une específicamente a IGF-I humano e IGF-II humano para inhibir la función de control de la proliferación,

diferenciación y/o apoptosis de células epiteliales tanto de IGF-I humano como de IGF-II humano y puede inhibir tanto IGF-I humano como IGF-II humano equivalentemente, y la actividad de unión del anticuerpo es una constante de unión de 5 x 10 9 M -1 o más medida con un biosensor BIACORE, donde las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada (V H) del anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NO: 5, 6 y 7, respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NO: 8, 9 y 10, respectivamente

Anticuerpo para el factor de crecimiento humano de tipo insulínico.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo para el factor de crecimiento de tipo insulínico (referido en adelante como IGF) y a un fragmento de anticuerpo derivado del anticuerpo. La presente invención se refiere adicionalmente a un ADN que codifica dicho anticuerpo y dicho fragmento de anticuerpo. La presente invención se refiere a un vector recombinante que comprende dicho ADN y a un transformante obtenido introduciendo dicho vector recombinante en una célula anfitriona. La presente invención se refiere adicionalmente a métodos para producir dicho anticuerpo y fragmento de anticuerpo utilizando dicho transformante, y a los usos diagnósticos, preventivos y terapéuticos de dicho anticuerpo y fragmento de anticuerpo.

Técnica anterior

El IGF es un factor que juega un papel muy importante en el control de la proliferación, diferenciación y muerte celular (apoptosis) de células epiteliales de la mama, la próstata, el pulmón, el colon y órganos similares, y su acción se lleva a cabo por medio de un receptor IGF (referido en adelante como IGF-R) existente sobre la superficie celular (Endocrine Reviews, 16, 3-34, 1995). Asimismo, se sabe que existe una proteína denominada proteína de unión a IGF (referida en adelante como IGFBP) y que regula la actividad de IGF promoviéndola o inhibiéndola (Endocrine Reviews, 16, 3-34, 1995).

En cuanto al IGF, existen dos tipos, IGF-I e IGF-II, y cada uno de ellos comprende un polipéptido de cadena sencilla y tiene una homología de aproximadamente 40% con una proinsulina precursora de la insulina a nivel de aminoácidos (Advances in Cancer Research, 68, 183-223, 1996). En cuanto al IGF-R existen tres tipos de receptores de insulina, receptor IGF-I (en adelante referido como IGF-IR) y receptor IGF-II (en adelante referido como IGF-IIR). Cada receptor de insulina e IGF-R pertenece a la familia de receptores de tipo tirosina quinasa y existe sobre la membrana celular en forma de un heterotetrámero a₂ß₂, después de formar el enlace S-S de una subunidad a de 135 kDa y una subunidad ß de 95 kDa formadas a partir de un precursor de cadena sencilla como resultado de su digestión con una proteasa (Endocrine Reviews, 16, 143-163, 1995, Breast Cancer Research & Treatment, 47, 235-253, 1998). El receptor de insulina y el IGF-IR tienen una homología de aproximadamente 60%, y la insulina y el IGF-IR, y el IGF y el receptor de insulina, se unen entre sí aunque débilmente y actúan (Journal of Biological Chemistry, 263, 11486-11492, 1988, Journal of Biological Chemistry, 268, 7393-7400, 1993). Se ha demostrado la existencia de un receptor híbrido que comprende la subunidad aß del receptor de insulina y la subunidad aß de IGF-IR, y se considera que el receptor híbrido tiene una afinidad de unión mayor por IGF-I que por la insulina y actúa como IGF-IR, pero su papel intravital no está claro (Endocrine Reviews, 16, 3-34, 1995, Endocrine Reviews, 16, 143-163, 1995). El IGF-IIR tiene una estructura de cadena sencilla, y existen tres regiones de unión al ligando en su región extracelular. Una de las regiones de unión al ligando es una región de unión a IGF-II, y las otras dos son regiones que se unen a proteínas que contienen manosa-6-fosfato [renina, proliferina, tiroglobulina, factor de crecimiento transformante endógeno ß (TGF-ß) y similares] (Endocrine Reviews, 16, 3-34, 1995). Se ha informado de que el TGF-ß endógeno es activado por su unión a IGF-IIR (Breast Cancer & Treatment, 52, 175-184, 1998, Hormone & Metabolic Research, 31, 242-246, 1999). El IGF-IIR no tiene actividad tirosina quinasa y se une solamente a IGF-II de entre los IGF. Puesto que IGF-II es degradado por su unión a IGF-IIR, se considera que IGF-IIR actúa como antagonista de IGF-II (Breast Cancer Research & Treatment, 52, 175-184, 1998).

Hasta ahora se conocen diez tipos de IGFBP (IGFBP-1 a IGFBP-10), y de ellos seis tipos (IGFBP-1 a IGFBP-6) tienen una elevada afinidad de unión por IGF (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 94, 12981-12986, 1997). IGFBP-1 a IGFBP-6 tienen una elevada homología de 40 a 60% a nivel de aminoácidos. Se ha revelado que IGFBP regula la función de IGF al experimentar diferentes modificaciones post-traduccionales tales como degradación y fosforilación y ejerciendo de ese modo influencia sobre la transferencia de IGF, la inhibición de la degradación y la unión al receptor (International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 28, 619-637, 1996, Endocrine Reviews, 18, 801-831, 1997). IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3 y IGFBP-5 tienen un caso de promoción de la acción de IGF y un caso de inhibición de la misma, y las acciones de IGFBP-2, IGFBP-3 e IGFBP-5 sobre IGF están reguladas por la degradación de IGFBP, y la acción de IGFBP-1 por la fosforilación de IGFBP-1, respectivamente (Endocrine Reviews, 16, 3-34,1995, International Journal of Biochemistry & cell Biology, 28, 619-637, 1996, Endocrinology & Metabolism Clinics of North America, 25, 591-614, 1996). Además, la afinidad de unión de IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3 y IGFBP-5 por IGF se reduce cuando se unen a un receptor específico existente sobre la membrana celular. Como resultado, se disocian IGFBP e IGF para formar IGF libre (Endocrine Reviews, 16, 3-34, 1995, International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 28, 619-637, 1996, Endocrinology & Metabolism Clinics of North America, 25, 591-614, 1996). Por otra parte, IGFBP-4 e IGFBP-6 tienen actividad inhibidora de la acción de IGF (Endocrine Reviews, 16, 3-34, 1995, Endocrinology & Metabolism Clinics of North America, 25, 591-614, 1996). En el ámbito intravital, 90% o más del IGF en sangre se une a IGFBP-3 y una subunidad lábil al ácido, y existe en forma de un complejo de elevado peso molecular de aproximadamente 150 kDa, inhibiendo de ese modo la degradación de IGF y su drenaje a la región extra-vascular (Journal of Biological Chemistry, 264, 11843-11848, 1989).

Tanto IGF-I como IGF-II muestran una potente actividad que promueve la proliferación para un gran número de células cancerosas (sarcoma, leucemia, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer hepático, cáncer pancreático, carcinoma renal, cáncer de glándula tiroides, cáncer de cerebro, cáncer ovárico, cáncer uterino) (British Journal of Cancer, 65, 311-320, 1992, Anticancer Research, 11, 1591-1595, 1991, Annals of Internal Medicine, 122, 54-59, 1995, Oncology, 54, 502-507, 1997, Endocrinology, 137, 1764-1774, 1996, European Journal of Haematology, 62, 191-198, 1999), y se ha identificado una expresión en exceso de IGF en un gran número de células cancerosas (British Journal of Cancer, 65, 311-320, 1992). Asimismo, se ha informado de que las cantidades de expresión de IGF-II e IGF-IR son mayores en células cancerosas metastásicas superiores que en células cancerosas metastásicas inferiores (International Journal of Cancer, 65, 812-820, 1996). Se ha revelado que tales funciones de IGF aparecen principalmente por medio de IGF-IR (Endocrinology, 136, 4298-4303, 1995, Oncogene, 28, 6071-6077, 1999), pero IGF-II también actúa por medio del receptor de insulina en células de cáncer de mama (Oncogene, 18, 2471-2479, 1999).

Se ha informado de que, en el caso de los ratones transgénicos que expresan en exceso IGF-I en células epiteliales de próstata, aproximadamente 50% de ellos desarrollan cáncer de próstata al cabo de aproximadamente 6 meses (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97, 3455-3460, 2000). También, se ha demostrado que la expresión de IGF-I e IGF-IR aumenta por la adquisición de la capacidad de proliferación independiente de andrógenos en un ratón modelo de transplante de células de cáncer de próstata humano (Cancer Research, 61, 6276-6280, 2001).

El IGF también está implicado en la proliferación de células cancerosas que reaccionan mutuamente con otros factores. Se ha informado de que la actividad de IGF-I es incrementada y la expresión de IGF-I y IGF-IR es inducida por estrógenos en células de cáncer de mama (Endocrinology, 136, 1296-1302, 1995, Journal of Biological Chemistry, 265, 21172-21178, 1990, Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 41, 537-540, 1992, British Journal of Cancer, 75, 251-257, 1997). Además, se sabe que el estrógeno inhibe la producción de IGFBP, reduce la expresión de IGF-IIR, e incrementa la expresión de enzima de degradación de IGFBP en células de cáncer de mama (Biochemical & Biophysical Research Communications, 193, 467-473, 1993,...

1. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo, que se une específicamente a IGF-I humano e IGF-II humano para inhibir la función de control de la proliferación, diferenciación y/o apoptosis de células epiteliales tanto de IGF-I humano como de IGF-II humano y puede inhibir tanto IGF-I humano como IGF-II humano equivalentemente, y la actividad de unión del anticuerpo es una constante de unión de 5 x 10⁹ M^-1 o más medida con un biosensor BIACORE, donde las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada (V_H) del anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NO: 5, 6 y 7, respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera (V_L) del anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por los SEQ ID NO: 8, 9 y 10, respectivamente.

2. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, donde el anticuerpo es un anticuerpo de un animal no humano o un anticuerpo recombinante.

3. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, donde el anticuerpo recombinante se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo quimérico humano, un anticuerpo injertado con CDR humana y un anticuerpo humano.

4. Un anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo, que se une específicamente a IGF-I humano e IGF-II humano para inhibir la función de control de la proliferación, diferenciación y/o apoptosis de células epiteliales tanto de IGF-I humano como de IGF-II humano y puede unirse a IGF-I humano y a IGF-II humano equivalentemente, y la actividad de unión del anticuerpo es una constante de unión de 5 x 10⁹ M^-1 o más medida con un biosensor BIACORE, donde la VH del anticuerpo de un animal no humano comprende la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2, y la VL del anticuerpo de un animal no humano comprende la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4.

5. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4, donde el anticuerpo de un animal no humano es producido por un hibridoma FERM BP-7978.

6. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, donde la VH del anticuerpo quimérico humano comprende la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2, y la VL del anticuerpo quimérico humano comprende la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 4.

7. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3 o 6, donde el anticuerpo quimérico humano comprende VH y VL del anticuerpo producido por FERM BP-7978.

8. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 6 y 7, donde el anticuerpo quimérico humano comprende una región constante de un anticuerpo humano.

9. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8, donde la región constante de un anticuerpo humano comprende la región constante de un anticuerpo humano de clase IgG1 y/o de clase k.

10. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 6 a 9, donde el anticuerpo quimérico humano es producido por FERM BP-7996.

11. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, donde el anticuerpo injertado con una CDR humana comprende una región constante de un anticuerpo humano.

12. El anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 11, donde la región constante de un anticuerpo humano comprende la región constante de un anticuerpo humano de clase IgG1 y/o de clase k.

13. El fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')², anticuerpo de cadena sencilla (scFv), región V dimerizada (fragmento bivalente), región V estabilizada por disulfuro (dsFv) y péptido que contiene CDR.

14. Un ADN que codifica el anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

15. Un vector recombinante que contiene el ADN de acuerdo con la reivindicación 14.

16. Un transformante que se obtiene introduciendo el vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 15 en una célula anfitriona.

17. Un método para producir un anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo, que comprende cultivar el transformante de acuerdo con la reivindicación 16 en un medio para producir y acumular el anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en un cultivo, y recuperar el anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo del cultivo.

18. Una composición farmacéutica que comprende al menos uno de un anticuerpo y uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 como ingrediente activo.

19. El uso de al menos uno de un anticuerpo y uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 como ingrediente activo para la preparación de una composición farmacéutica para tratar cánceres sólidos, diabetes o artritis reumatoide.

20. Una composición diagnóstica que comprende al menos uno de un anticuerpo y uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

21. El uso de al menos uno de un anticuerpo y uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la preparación de una composición diagnóstica para diagnosticar cánceres sólidos, diabetes o artritis reumatoide.

22. Un método in vitro para la diagnosis de enfermedades mediadas por IGF-I e IGF-II humano, que comprende detectar o determinar inmunológicamente IGF-I e IGF-II humano en la muestra utilizando al menos uno de un anticuerpo y uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

23. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 22, donde la muestra se selecciona del grupo que consiste en una célula aislada o una solución desorganizada de la misma, un tejido o una solución desorganizada del mismo, un sobrenadante de un cultivo celular, suero, efusión pleural, ascitis y fluido oftálmico.

24. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o uno de sus fragmentos de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para tratar cánceres sólidos, diabetes o artritis reumatoide.