Composiciones y métodos relacionados con STOP-1.

Anticuerpo monoclonal que se une específicamente a los aminoácidos 33-52 ó 33-53 de STOP-1 humana mostrada en la figura 2,

en el que el anticuerpo bloquea la unión de STOP-1 a las células.

Composiciones y métodos relacionados con STOP-1.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a polipéptidos STOP-1, anticuerpos, moléculas de ácido nucleico, antagonistas, agonistas, potenciadores y composiciones relacionadas con STOP-1, y métodos de fabricación y utilización de los mismos, que incluyen métodos para el diagnóstico y el tratamiento de tumores en mamíferos. La presente invención se refiere además al diagnóstico y al tratamiento de trastornos que implican angiogénsis y vasculogénsis (por ejemplo, trastornos cardiovasculares, así como oncológicos) .

ANTECEDENTES E INTRODUCCIÓN DE LA INVENCIÓN

El crecimiento cellular incontrolado es la causa de muchas enfermedades en una variedad de tipos de células. Por ejemplo, el cáncer aparece cuando existe un incremento en el número de células anormales, o neoplásicas, derivadas de un tejido normal que proliferan para formar una masa tumoral. Las células tumorales invaden a menudo los tejidos adyacentes y se pueden extender a través del sistema sanguíneo o linfático a nódulos linfáticos regionales y a sitios distantes a través de un proceso denominado metástasis. En un crecimiento canceroso, una célula prolifera bajo condiciones en que las células normales no crecerían. El cáncer se manifiesta en una amplia variedad de formas, caracterizadas por diferentes grados de invasividad y agresividad. Los tumores malignos (cánceres) son la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, después del ataque al corazón (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993) ) .

Se ha dedicado mucha investigación a descubrir nuevos tratamientos para trastornos proliferativos celulares, tales como el cáncer. A pesar de los avances recientes, existe una gran necesidad por identificar y entender el papel de nuevas dianas celulares para la modulación de la proliferación celular y para desarrollar métodos alternativos o más eficaces de tratamiento y agentes terapéuticos y de diagnóstico. También existe la necesidad de desarrollar agentes terapéuticos alternativos y métodos para el tratamiento de tipos de células específicas y para el tratamiento de enfermedades causadas por o asociadas con la proliferación anormal de células, tales como los cánceres. Por ejemplo, la desmoplasia es la hiperplasia de fibroblastos y la formación desproporcionada de tejido conectivo fibroso, especialmente en el estroma de carcinomas. La desmoplasia es el sello distintivo de la invasión tumoral y la malignidad. Los tumores desmoides y los fibroides abdominales son nódulos o masas relativamente grandes de tejido conectivo de tipo cicatriz inhabitualmente firme resultante de la proliferación activa de fibroblastos, que tiene lugar más frecuentemente en los músculos abdominales de mujeres que han tenido niños; los fibroblastos se infiltran alrededor del músculo y la fascia.

En la vida postnatal, la vasculogénesis (células endoteliales que forman una red tubular primaria) y la angiogénsis (el crecimiento o rebrote de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos existentes) juegan papeles críticos en la patofisiología del trastorno neoplásico (Semenza, G.L., (2003) Ann. Rev, Med. 54:17-28) . La distinction enter vasculogénesis y angiogénesis no es absoluta y se solapan (Ribatti, D et al., (2001) Mech.Dev. 100:157-163) . Ambos requieren la proliferación de células endoteliales, migración, reorganización tridimensional de nuevos agregados formados y utilizan mecanismos adhesivos de matrices extracelulares similares (Ribatti, supra) . Se ha observado que la utilización de terapias antiangiogénicas, tales como el anticuerpo contra el crecimiento endotelial vascular (VEGF) denominado Avastin, es útil en el tratamiento de cánceres.

Otra proteína celular, referida aquí como STOP-1 o UNQ762, se ha observado que se sobreexpresa en ciertos tumores (por ejemplo, WO 01/163318, WO 01/68848, WO 02/00690, WO 02/08284, WO 02/16602, WO 02/42487, WO 02/071928) . Se han descrito anticuerpos policlonales contra STOP-1 (por ejemplo, WO 02/42487) . Aunque ha habido cierta discusión sobre el reconocimiento de STOP-1 para tratar cánceres y enfermedades asociadas con la angiogénesis (por ejemplo, WO 01/163318, WO 01/68848, WO 02/00690. WO 02/08284, WO 02/16602, WO 02/42487, WO 00/71581, WO 02/00690) , existe la necesidad de explorar adicionalmente la biología de la proteína STOP-1 para identificar agentes terapéuticos alternativos y más eficaces y métodos para el diagnóstico y el tratamiento del crecimiento celular no controlado y enfermedades causadas por, asociadas con o complicadas por angiogénesis excesiva e insuficiente.

La presente invención vadirigida a estas necesidades y otras mediante la disposición de nuevos polipéptidos STOP-1, anticuerpos, moléculas de ácido nucleico, composiciones y métodos que incorporan conocimiento adicional sobre la proteína STOP-1. Entre otras cosas, la presente memoria muestra que el STOP1 se sobreexpresan en el estroma de varios tipos de tumores. La presente memoria muestra que la sobreexpresión de STOP-1 solo puede ser tumorigénico. Además, la presente memoria demuestra que la proteína STOP-1 se puede secretar y que la secreción es necesaria para la tumorigénesis. Además, la presente memoria muestra que el estado de glicosilación de STOP-1 afecta si se secreta y que la eliminación de un sitio de N-glicosilación, por ejemplo, mediante la sustitución del aminoácido en la posición 186 (Asn) por alanina da lugar a una pérdida de secreción. La presente memoria muestra que el enlace disulfuro entre las proteínas STOP-1 puede tener lugar en una cisteína 55 en el cultivo en el dominio de triple hélice de STOP-1. Adicionalmente, la presente memoria muestra que la proteína STOP-1 puede formar un complejo con sí mismo como dímero, trímero y hexámero y que el extremo C-terminal de la proteína es suficiente para la oligomerización, mientras que no es necesaria una región relacionada con el dominio de triple hélice de colágeno. La presente memoria también muestra una pluralidad de agentes que se unen específicamente a STOP-1, que incluyen la región C-terminal y región N-terminal de la proteína, así como secuencias de ácido nucleico y proteínas que las codifican. Además, la presente memoria muestra que la expresión de STOP-1 se puede modular por la sobreexpresión de proteínas en el mecanismo de señalización de WNT que es conocida por causar el cáncer de mama en ratones, por ejemplo, la sobreexpresión de WNT. Adicionalmente, la presente memoria muestra que el STOP-1 se puede divider por proteasas que se sobreexpresan en los mismos tumores que STOP-1, por ejemplo, MMP-9. Además, la presente memoria muestra que un método para producir polipéptidos STOP-1 mediante la expresión de los polipéptidos en líneas celulares deficientes en la síntesis de proteoglicanos. La presente memoria muestra que el STOP-1 se une a la superficie de células, tales como células del cáncer y células endoteliales. La presente memoria muestra moléculas antagonistas que pueden inhibir la interacción de STOP-1 con la superficie de las células. La presente memoria muestra moléculas que pueden potenciar la unión de STOP-1 con la superficie de células. La presente memoria también se refiere al papel de STOP-1 en la angiogénesis y vasculogénesis y métodos y composiciones para el tratamiento de trastornos para cuyo tratamiento se mejoraría mediante la modulación de la angiogénsis y la vasculogénesis. Estos datos y otros proporcionados aquí, junto con otra descripción en la presente solicitud, enseñan métodos nuevos, mejores y/o alternativos para utilizar la proteína STOP-1 o composiciones relacionadas con la misma.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona nuevos agentes terapéuticos, agentes de diagnóstico y métodos para el tratamiento y prevención de la proliferación celular no controlada, incluyendo cáncer y otras enfermedades, mediante el marcaje de la actividad, expresión y regulación de STOP-1 tal como se define en las reivindicaciones. La presente invención proporciona nuevos agentes terapéuticos, agentes de diagnóstico y métodos para el tratamiento de cualquier enfermedad médica que tiene sucesos angiogénicos o vasculogénicos en exceso o inapropiados, subóptimos, mediante el marcaje de la actividad, expresión y regulación de STOP-1 tal como se define en las reivindicaciones.

Según una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a los aminoácidos 33-53 o 33-52 de STOP-1 humano, y un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a los aminoácidos 94-243 de STOP-1 humano, tal como se define en las reivindicaciones. El STOP-1 humano es muestra en la figura... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo monoclonal que se une específicamente a los aminoácido.

3. 52 .

3. 53 de STOP-1 humana mostrada en la figura 2, en el que el anticuerpo bloquea la unión de STOP-1 a las células.

2. Anticuerpo monoclonal que se une específicamente a los aminoácido.

9. 243 de STOP-1 humana mostrada en la figura 2, en el que el anticuerpo potencia la unión de STOP-1 a las células.

3. Anticuerpo monoclonal, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo monoclonal se une a una forma oligomérica de STOP-1 humana.

4. Anticuerpo monoclonal, según la reivindicación 1, que comprende (a) una primera secuencia de aminoácidos TINNYD; (b) una segunda secuencia de aminoácidos GYISPPSGATY; y (c) una tercera secuencia de aminoácidos CARMVGMRRGVMDY, en el que la primera secuencia de aminoácidos está en los residuo.

2. 33 de una cadena pesada según el sistema de numeración Kabat, la segunda secuencia de aminoácidos está en los residuo.

4. 58 de una cadena pesada según el sistema de numeración Kabat y la tercera secuencia de aminoácidos está en los residuo.

9. 102 de una cadena pesada según el sistema de numeración Kabat, o una variante de dicho anticuerpo que se une a STOP-1; o que se produce mediante la línea celular de hibridoma 6B12.1.7 depositada el 28 de marzo de 2003 con la American Type Culture Collection (ATCC) con número de acceso PTA-5104.

5. Anticuerpo monoclonal, según la reivindicación 2, que comprende:

(a) la primera secuencia de aminoácidos TISGSD; (b) la segunda secuencia de aminoácidos GRISPYGGNTN; y

(c) la tercera secuencia de aminoácidos CARVGGLKLLFDY; o (a) la primera secuencia de aminoácidos TITNSD;

(b) la segunda secuencia de aminoácidos ATIYPYGGYTY; y (c) la tercera secuencia de aminoácidos CARGGGMDGYVMDY; o (a) la primera secuencia de aminoácidos TISGSW; (b) la segunda secuencia de aminoácidos AWIAPYSGATD; y (c) la tercera secuencia de aminoácidos CAREGGLYWVFDY; o (a) una primera secuencia de aminoácidos TISNYG; (b) una segunda secuencia de aminoácidos GRISPSNGSTY; y (c) una tercera secuencia de aminoácidos CAKCSVRFAY,

en el que la primera secuencia de aminoácidos está en los residuo.

2. 33 de una cadena pesada según el sistema de numeración Kabat, la segunda secuencia de aminoácidos está en los residuo.

4. 58 de una cadena pesada según el sistema de numeración Kabat y la tercera secuencia de aminoácidos está en los residuos 92102 de una cadena pesada según el sistema de numeración Kabat, o una variante de dicho anticuerpo que se une a STOP-1.

6. Anticuerpo monoclonal, según la reivindicación 4 ó 5, en el que el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de:

(a) la secuencia de cadena pesada de la figura 27;

(b) la secuencia de cadena pesada de la figura 28;

(c) la secuencia de cadena pesada de la figura 29;

(d) la secuencia de cadena pesada de la figura 30;

(e) la secuencia de cadena pesada de la figura 31; o

(f) la secuencia de cadena pesada de la figura 34; o una variante de dicho anticuerpo que se une a STOP-1.

7. Anticuerpo monoclonal, según la reivindicación 6, que comprende además la secuencia de aminoácidos de:

(a) la secuencia de cadena ligera de la figura 27; o

(b) la secuencia de cadena ligera de la figura 33; o una variante de dicho anticuerpo que se une a STOP-1.

8. Anticuerpo monoclonal que se une específicamente a STOP-1 humana mostrada en la figura 2 que tiene una característica biológica de un anticuerpo:

(i) en el que el anticuerpo se une específicamente a los aminoácido.

9. 243 de STOP-1 humana y tiene una característica biológica de un anticuerpo seleccionado seleccionado del grupo que consiste en S7 codificado por la molécula de ácido nucleico depositada el 25 de marzo de 2003 con la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-5090, y S4 codificado por la molécula de ácido nucleico depositada el 25 de marzo de 2003 con la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-5086, en el que la característica biológica es la capacidad de potenciar la unión de STOP-1 a células; o

(ii) en el que el anticuerpo se une específicamente a los aminoácido.

3. 52 .

3. 53 de STOP-1 humana y tiene una característica biológica de un anticuerpo 6B12 producido por la línea celular de hibridoma 6B12.1.7

depositada el 28 de marzo de 2003 con la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-5104, en el que la característica biológica es la capacidad de bloquear la unión de STOP-1 a las células.

9. Anticuerpo monoclonal que se une específicamente a STOP-1 humana mostrada en la figura 2, en el que la unión del anticuerpo a STOP-1 se puede inhibir por un segundo anticuerpo monoclonal:

(i) en el que el anticuerpo se une específicamente a los aminoácido.

9. 243 de STOP-1 humana y el segundo anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en S7 codificado por la molécula de ácido nucleico depositada el 25 de marzo de 2003 con la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-5090, S4 codificado por la molécula de ácido nucleico depositada el 25 de marzo de 2003 con la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-5086, S9 codificado por la molécula de ácido nucleico depositada el 25 de marzo de 2003 con la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-5087 y S16 codificado por la molécula de ácido nucleico depositada el 25 de marzo de 2003 con la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-5089; o

(ii) en el que el anticuerpo se une específicamente a los aminoácido.

3. 52 .

3. 53 de STOP-1 humana y el segundo anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en F5 codificado por la molécula de ácido nucleico depositada el 25 de marzo de 2003 con la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-5088 y 6B12 producido por la línea celular de hibridoma 6B12.1.7 depositada el 28 de marzo de 2003 con la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-5104.

10. Anticuerpo monoclonal, según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende las secuencias de cadena ligera y pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en F5 codificado por la molécula de ácido nucleico depositada el 25 de marzo de 2003 con la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-5088 y 6B12 producido por la línea celular de hibridoma 6B12.1.7 depositada el 28 de marzo de 2003 con la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-5104, y variantes de los mismos que se unen a STOP-1.

11. Anticuerpo monoclonal, según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo comprende las secuencias de cadena ligera y pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en (i) S7 codificado por la molécula de ácido nucleico depositada el 25 de marzo de 2003 con la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-5090, S4 codificado por la molécula de ácido nucleico depositada el 28 de marzo de 2003 con la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-5086, S9 codificado por la molécula de ácido nucleico depositada el 28 de marzo de 2003 con la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-5087 y S16 codificado por la molécula de ácido nucleico depositada el 28 de marzo de 2003 con la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso PTA-5089, y variantes de los mismos que se unen a STOP-1.

12. Anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado, o un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo biespecífico.

13. Anticuerpo, según la reivindicación 12, en el que el anticuerpo está conjugado a un agente seleccionado del grupo que consiste en un agente inhibidor del crecimiento, un agente citotóxico, un agente de detección, un agente que mejora la biodisponibilidad y un agente que mejora la semivida del anticuerpo.

14. Anticuerpo, según la reivindicación 13, en el que dicho agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en una toxina, un antibiótico y un isótopo radioactivo.

15. Anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que dicho anticuerpo se produce en bacterias o células CHO.

16. Molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo que tiene una secuencia tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4-7 y 10-12.

17. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 16.

18. Célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 16.

19. Composición que comprende el anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

20. Composición que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 16.

21. Composición que comprende el anticuerpo monoclonal, según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, 6 (e) , 8 (ii) , 9 (ii) y 10, en la que el anticuerpo bloquea la unión de STOP-1 a las células y un portador farmacéuticamente aceptable.

22. Composición, según la reivindicación 21, que comprende además un agente de reconocimiento estromal seleccionado entre un anticuerpo que se une específicamente a proteína de activación de fibroblastos (FAP) , fascina, HSP47, mesotelina o antígeno de células madre de próstata.

23. Composición, según la reivindicación 22, en la que el agente de reconocimiento estromal está unido covalentemente al anticuerpo monoclonal.

24. Composición, según la reivindicación 22 ó 23, en la que el agente de reconocimiento estromal reconoce una célula estromal de un tumor.

25. Composición que comprende el anticuerpo monoclonal, según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 5, 6 (a) (d) (f) , 7, 8 (i) , 9 (i) y 11, en la que el anticuerpo potencia la unión de STOP-1 a células y un portador farmacéuticamente aceptable.

26. Método para producir un anticuerpo anti-STOP-1 que comprende la etapa de cultivar una célula que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 16.

27. Método, según la reivindicación 26, en el que la célula es una célula bacteriana o una célula de mamífero.

28. Método para determinar la presencia de un polipéptido STOP-1 en una muestra que comprende exponer una muestra sospechosa de contener el polipéptido STOP-1 a un anticuerpo anti-STOP-1, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y determinar la unión de dicho anticuerpo a un componente de dicha muestra.

29. Método de diagnóstico o monitorización de un tumor de un paciente que comprende la etapa de comparar la cantidad de proteína STOP-1 en un tejido normal con la cantidad de proteína STOP-1 en un tejido de prueba obtenido del paciente utilizando el anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 to 12.

30. Método, según la reivindicación 29, en el que la cantidad de STOP-1 en el tejido normal y el tejido tumoral se evalúa en base a la expresión en células estromales.

31. Anticuerpo monoclonal, según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, 6 (e) , 8 (ii) , 9 (ii) y 10, en el que el anticuerpo bloquea la unión de STOP-1 a células para utilizar en un método de inhibición del crecimiento de un turmo que sobreexpresa STOP-1, comprendiendo el método administrar a un paciente dicho anticuerpo en una cantidad eficaz para inhibir el crecimiento del tumor en el paciente.

32. Utilización de un anticuerpo monoclonal, según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4, 6 (e) , 8 (ii) , 9 (ii) y 10, en la que el anticuerpo bloquea la unión de STOP-1 a células en la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento de un tumor que sobreexpresa STOP-1.

33. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, en la que el anticuerpo bloquea la unión de STOP-1 a células para utilizar en un método de inhibición del crecimiento de un tumor que sobreexpresa STOP1, comprendiendo el método administrar a un paciente dicho anticuerpo en una cantidad eficaz para inhibir el crecimiento del tumor en el paciente.

34. Anticuerpo monoclonal para utilizar, según la reivindicación 31, la utilización, según la reivindicación 32, o la composición para utilizar, según la reivindicación 33, en los que el tumor tiene compartimentos estromales.

35. Anticuerpo monoclonal para utilizar, según la reivindicación 31, la utilización, según la reivindicación 32, o la composición para utilizar, según la reivindicación 33, en los que el tumor se selecciona del grupo que consiste en adenocarcinomas, carcinoma hepatocelular, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, melanoma, cáncer de endometrio, glioma y cáncer pancreático.

36. Artículo de fabricación, que comprende:

(a) una composición de materia, según la reivindicación 21, en la que el anticuerpo bloquea la unión de STOP-1 a las células;

(b) un recipiente que contiene dicha composición; y

(c) una etiqueta fijada a dicho recipiente, o un prospecto incluido en dicho recipiente que se refiere a la utilización de dicha composición en el tratamiento de un trastorno proliferativo.

37. Anticuerpo monoclonal, según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 5, 6 (a) - (d) (f) , 7, 8 (i) , 9 (i) y 11, en el que el anticuerpo potencia la unión de STOP-1 a las células para utilizar en un método de inducción de la angiogénesis en un paciente, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo.

38. Utilización de un anticuerpo monoclonal, según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 5, 6 (a) - (d) (f) , 7, 8 (i) , 9 (i) y 11, en la que el anticuerpo potencia la unión de STOP-1 a células en la fabricación de un medicamento para inducir la angiogénesis en un paciente.

39. Composición, según la reivindicación 25, en la que el anticuerpo potencia la unión de STOP-1 a células para utilizar en un método de inducción de la angiogénesis en un paciente, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo.

40. Artículo de fabricación, que comprende:

(a) una composición de materia, según la reivindicación 25, en la que el anticuerpo potencia la unión de STOP-1 a las células;

(b) un recipiente que contiene dicha composición; y

(c) una etiqueta fijada a dicho recipiente, o un prospecto incluido en dicho recipiente que se refiere a la utilización

de dicha composición en el tratamiento o mejora de una enfermedad que se beneficiaría de una angiogénesis 10 incrementada.