Anticuerpos monoclonales humanos para quinasa-1 de tipo receptor de activina (ALK-1).

Un anticuerpo monoclonal neutralizante anti ALK-1, o una parte de unión a antígeno del mismo,

en el que dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno compite de forma cruzada por la unión con ALK-1 con un anticuerpo que comprende:

a. un dominio variable de cadena pesada de SEC ID Nº: 6 y un dominio variable de cadena ligera de SEC ID Nº: 8; o

b. la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada codificada por la secuencia de nucleótidos del inserto hallado en el clon depositado con el número de acceso de ATCC PTA-6864 y la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera codificada por la secuencia de nucleótidos del inserto hallado en el clon depositado con el número de acceso de ATCC PTA-6865.

Anticuerposmonoclonales humanos para quinasa-1 de tipo receptor de activina (ALK-1)

Campo de la invención La presente divulgación se refiere a anticuerpos monoclonales humanos y partes de unión a antígeno de los mismos que se unen al dominio extracelular (ECD) de quinasa-1 de tipo receptor de activina (ALK-1) . La divulgación también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican dichos anticuerpos y partes de unión a antígeno, procedimientos para realizar anticuerpos anti-ALK-1 y partes de unión a antígeno, composiciones que comprenden estos anticuerpos y partes de unión a antígeno y procedimientos para usar los anticuerpos, partes de unión a antígeno y composiciones.

Antecedentes de la divulgación ALK-1 es un receptor de superficie celular de tipo I para receptor de factor de crecimiento transformante beta de tipo 1 (TGF-beta-1) . ALK-1 humana es un polipéptido de 503 aminoácidos, que incluye una secuencia señal (aminoácidos: 1-21) , un dominio de unión a ligando de TGF-beta-1 extracelular N-terminal o ECD (aminoácidos: 22118) , un único dominio transmembrana (aminoácidos: 119-141) , un dominio regulador rico en glicina/serina (GS) (aminoácidos: 142-202) y un dominio de serina-treonina quinasa C-terminal (202-492) . La secuencia de aminoácidos de ALK-1 humana desvelada en Attisano y col. Cell, 1993, vol. 75, páginas 671-680 incluye Ser en la posición 172 (registro de GenBank L17075) , mientras que la patente de Estados Unidos 6.316.217 reivindica la secuencia de aminoácidos de ALK-1 humana con Thr en la posición 172 (registro de Genbank NM_000020) . El gen de ACVRL1 que codifica una ALK-1 humana de longitud completa desvelada en Attisano y col, está disponible en el mercado de Invitrogen Inc., Clon ID IOH21048. Aunque ALK-1 comparte el 60-80 % de homología global con otros receptores de tipo I (ALK-2 a ALK-7) , ECD de ALK-1 es notablemente divergente de los ECD de otros miembros de la familia de ALK. Por ejemplo, en seres humanos, solamente ECD de ALK-2 está relacionado significativamente con ECD de ALK-1 (compartiendo aproximadamente el 25 % de identidad de aminoácidos) . Patente de Estados Unidos 6.316.217; ten Dijke y col. Oncogene, 1993, vol. 8, páginas 2879-2887; Attisano y col. Cell, 1993, vol. 75, páginas 671-680.

En general, los ligandos de superfamilia de TGF-beta ejercen sus actividades biológicas mediante unión a complejos receptores heteroméricos de dos tipos (I y II) de serina/treonina quinasas. Los receptores de tipo II son quinasas constitutivamente activas que fosforilan receptor de tipo I tras unión a ligando. A su vez, las quinasas de tipo I activadas fosforilan corrienteabajo lasmoléculas deseñalización incluyendo los diversos Smad, quesetranslocan al núcleo y conducen a una respuesta transcripcional. Heldin y col. Nature, 1997, vol. 390, páginas 465-471. En el caso de ALK-1, los inventores han mostrado que Smad1 se fosforila específicamente y se transloca al núcleo en el que regula directamentela expresión de los genes sensibles a Smad1 Id1 y EphB2.

ALK-1 se expresa en gran medida y selectivamente en células endoteliales y otros tejidos altamente vascularizados tales como placenta o cerebro. Los inventores han mostrado por realización de perfiles de Affymetrix y RT-PCR en tiempo real que la expresión de ALK-1 en células endoteliales excede en gran medida la expresión de sus coreceptores activina de tipo II y endoglina, su ligando TGF-beta-1 o ALK-5. Las mutaciones en ALK-1 están asociadas con telangiectasia hemorrágica hereditaria (HHT) , lo que sugiere un papel crítico para ALK-1 en el control del desarrollo o reparación de vasos sanguíneos. Abdalla y col. J. Med. Genet, 2003, vol. 40, páginas 494-502; Sadick y col. Hematological/The Hematology J., 2005, vol. 90, 818-828. Además, dos estudios independientes de ratones knockout para ALK-1 proporcionan las pruebas in vivo clave para la función de ALK-1 durante la angiogénesis. Oh y col. Proc Nati Acad Sci USA, 2000, vol. 97, páginas 2626-2631; Urness y col. Nature Genetics, 2000, vol.26, páginas 328-331.

La angiogénesis es el proceso fisiológico que implica la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes y/o células madre endoteliales en circulación. Este es un proceso normal en el crecimiento y desarrollo, así como en la curación de heridas. Sin embargo, esto también es una etapa fundamental en la transición de tumores de un estado durmiente a un estado maligno. Hanahan y Folkman, “Patterns and Emerging Mechanisms of the Angiogenic Switch During Tumorigenesis, ” Cell, 86 (3) :353-364, 1996; Carmeliet, “Angiogenesis in Health and Disease” Nature Medicine, 9 (6) :653-660, 2003; Bergers y Benjamin, “Tumoreigenesis and the Angiogenic Switch, ” Nature Reviews, 3:401-410, 2003. En enfermedades como cáncer, el cuerpo pierde la capacidad para mantener angiogénesis equilibrada. Nuevos vasos sanguíneos alimentan tejidos enfermos, destruyen tejidos normales, y en el caso de algunos cánceres, los nuevos vasos pueden permitir que las células tumorales escapen a la circulación y se alojen en otros órganos (metástasis tumoral) . Los inhibidores de angiogénesis, incluyendo anticuerpos monoclonales (mAb) , son una clase muy prometedora de fármacos dirigidos contra este proceso anómalo para bloquear o ralentizar el crecimiento tumoral.

Además de un papel en el crecimiento de tumor sólido y metástasis, otras afecciones notables con un componente angiogénico son, por ejemplo, artritis, psoriasis, degeneración macular relacionada con la edad neovascular y retinopatía diabética. Bonnet y col. “Osteoarthritis, Angiogenesis and Inflammation, ” Rheumatology, 2005, vol. 44, páginas. 7-16; Creamer y col. “Angiogenesis in psoriasis, ” Angiogenesis, 2002, vol. 5, páginas. 231-236; Clavel y col.

“Recent data on the role for angiogenesis in rheumatoid arthritis, ” Joint Bone Spine, 2003, vol. 70, páginas. 321-326; Anandarajah y col. “Pathogenesis of psoriatic arthritis, ” Curr. Opin. Rheumatol., 2004, vol. 16, páginas 338-343; Ng y col. “Targeting angiogenesis, the underlying disorder in neovascular age-related macular degeneration, ” Can. J. Ophthalmol., 2005, vol. 40, páginas 352-368; Witmer y col. “Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease, ” Progress in Retinal & Eye Research, 2003, vol. 22, páginas 1-29; Adamis y col. “Angiogenesis and ophthalmic disease, ” Angiogenesis, 1999, vol. 3, páginas 9-14.

Se espera que las terapias anti-angiogénicas sean crónicas en la naturaleza. En consecuencia, se prefieren dianas con función endotelial altamente selectiva, tales como ALK-1, para reducir el desgaste resultante de efectos secundarios. Además, dada la notable divergencia del ECD de ALK-1 de los ECD de otros miembros de la familia de ALK, se espera que los mAb inducidos contra el ECD de ALK-1 humana se dirijan selectivamente a ALK-1. Basándose en estas consideraciones, un anticuerpo monoclonal contra el dominio extracelular de ALK-1 que puede inhibir la dimerización con el receptor de tipo II y por lo tanto bloquear la fosforilación de Smad1 y la respuesta transcripcional corriente abajo es altamente deseable.

R&D Systems, Inc. fabrica y vende un anticuerpo monoclonal anti-ALK-1 humana monoclonal (Cat. Nº MAB370) producido a partir de un hibridoma resultante de la fusión de mieloma de ratón con linfocitos B obtenidos de un ratón inmunizado con dominio extracelular de ALK humana recombinante derivado de NSO purificado. Los inventores han mostrado que este anticuerpo no neutraliza la interacción entre ALK-1 y TGF-beta-1 ni anula la fosforilación de Smad1. Se ha generado antisueros de conejo contra un péptido sintético correspondiente a una parte de la región yuxtamembrana intracelular de ALK-1 (restos de aminoácidos 145-166) , acoplada a hemocianina de lapa californiana (KLH) (patente de Estados Unidos 6.692.925) y contra el dominio extracelular de ALK-1 completo excepto para la secuencia principal (Lux y col., J. Biol. Chem., 1999, vol. 274, páginas 9984-9992) . Abdalla y col (Human Mol. Gen., 2000, vol. 9, páginas 1227-1237) presentan generación de un anticuerpo policlonal para ALK-1 usando una construcción de virus vaccinia recombinante. R&D Systems, Inc. fabrica y vende un anticuerpo anti-ALK1 humana policlonal (Cat Nº AF370) producido en cabras inmunizadas con dominio extracelular de ALK-1 humana recombinante, derivado de NS0 purificado.

Hasta la fecha, no se han presentado anticuerpos monoclonales completamente humanos para el ECD de ALK-1, y nadie ha demostrado la eficacia de ningún anticuerpo monoclonal para el ECD de ALK-1 al anular la ruta de señalización de ALK-1/TGF-beta-1/Smad1.... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal neutralizante anti ALK-1, o una parte de unión a antígeno del mismo, en el que dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno compite de forma cruzada por la unión con ALK-1 con un anticuerpo que comprende:

a. un dominio variable de cadena pesada de SEC ID Nº: 6 y un dominio variable de cadena ligera de SEC ID Nº: 8; o

b. la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada codificada por la secuencia de nucleótidos del inserto hallado en el clon depositado con el número de acceso de ATCC PTA-6864 y la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera codificada por la secuencia de nucleótidos del inserto hallado en el clon depositado con el número de acceso de ATCC PTA-6865.

2. El anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende:

a. una cadena pesada que utiliza una secuencia de línea germinal de VH 4-31 humana; y

b. una cadena ligera que utiliza una secuencia de línea germinal de V A27 humana.

3. El anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la secuencia de aminoácidos de dicha cadena pesada es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de línea germinal de VH 4-31 humana, y en el que la secuencia de aminoácidos de dicha cadena ligera es al menos 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de línea germinal de V A27 humana.

4. El anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho anticuerpo comprende un dominio VH que es al menos 90 % idéntico a la secuencia de aminoácidos deSEC ID Nº: 6.

5. El anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho anticuerpo comprende un dominio VL que es al menos 90 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 8.

6. El anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho anticuerpo comprende un dominio VH que es al menos 90 % idéntico a la secuencia de aminoácidos deSEC ID Nº: 6 y un dominio VL que es al menos 90 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 8.

7. El anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho anticuerpo comprende un dominio VH que es al menos 95 % idéntico a la secuencia de aminoácidos deSEC ID Nº: 6 y un dominio VL que es al menos 95 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 8.

8. El anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho anticuerpo comprende un dominio VH que es al menos 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos deSEC ID Nº: 6 y un dominio VL que es al menos 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 8.

9. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG, o se deriva de la misma.

10. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho anticuerpo es una molécula de IgG1 o de IgG2.

11. El anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno se derivatiza o se une con otra molécula.

12. El anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicha molécula es otro anticuerpo, una gente de detección, un marcador, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, un péptido o una proteína.

13. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 112; o una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

14. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con

una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que cada vector comprende una secuencia de control de la expresión unida operativamente a la molécula de ácido nucleico; o un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el vector comprende una secuencia de control de la expresión unida operativamente con la molécula de ácido nucleico.

15. Una célula huésped que comprende

a. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12;

b. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera del anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12;

c. un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que cada vector comprende una secuencia de control de la expresión unida operativamente con la molécula de ácido nucleico; o

d. un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el vector comprende una secuencia de control de la expresión unida operativamente con la molécula de ácido nucleico.

16. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 y un vehículo fisiológicamente aceptable.

17. Uso del anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 16 para la fabricación de un medicamento.

18. Un anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 16, para su uso en terapia.

19. Uso del anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 16 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, degeneración macular relacionada con la edad, ceguera diabética, endometriosis, neovascularización ocular, psoriasis o artritis reumatoide en un mamífero.

20. El anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 16 para su uso en el tratamiento de cáncer, degeneración macular relacionada con la edad, ceguera diabética, endometriosis, neovascularización ocular, psoriasis o artritis reumatoide en un mamífero.

21. Uso de:

a. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12; o

b. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera del anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12;

para la fabricación de un medicamento.

22. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12; o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera del anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12;

23. Uso de:

para su uso en terapia.

a. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12; o

b. una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera del anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12;

para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, degeneración macular relacionada con la edad, ceguera diabética, endometriosis, neovascularización ocular, psoriasis o artritis reumatoide en un mamífero.

24. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada, y una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera, de un anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12; o una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12;

para uso en el tratamiento de cáncer, degeneración macular relacionada con la edad, ceguera diabética, endometriosis, neovascularización ocular, psoriasis o artritis reumatoide en un mamífero.

25. El anticuerpo, parte de unión a antígeno o composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20 para su uso en el tratamiento de cáncer, o el uso de acuerdo con la reivindicación 19 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, en el que el cáncer es melanoma cutáneo o intraocular, mesotelioma, carcinoma de células renales, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, un tumor cerebral primario o secundario, carcinoma del cuello uterino, cáncer de la uretra, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer testicular, cáncer hepatobiliar, cáncer del conducto hepático, cáncer del conducto biliar, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer ovárico, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de colon, cáncer rectal, o cáncer de la región anal.

26. Uso de un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEC ID Nº: 2 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEC ID Nº: 4 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer hepatobiliar en un mamífero.

27. Un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEC ID Nº: 2 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEC ID Nº: 4 para su uso en el tratamiento de cáncer hepatobiliar en un mamífero.

28. El anticuerpo, parte de unión a antígeno o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20, 25 y 27,

comprendiendo la molécula de ácido nucleico aislada una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y comprendiendo la molécula de ácido nucleico aislada una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera, de un anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, o la molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada y una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera, de un anticuerpo o parte de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para su uso de acuerdo con la reivindicación 24, o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19, 23, 25 y 26;

en el que el mamífero es un ser humano.

CONCENTRACIÓN DE mAb (Nm)