Cuantificación de genomas de células inmunitarias adaptativas en una mezcla compleja de células.

Un método de determinación de una proporción de linfocitos T o linfocitos B en una muestra en relación con el número total de genomas de entrada contenidos en dicha muestra que comprende:

A) amplificar por PCR multiplexada y secuenciar:

i) secuencias oligonucleotídicas de CDR3 reordenadas de locus de receptores de linfocitos T (TCR) de linfocitos T o locus de inmunoglobulinas (Ig) de linfocitos B en dicha muestra para obtener un número total de secuencias biológicas de salida, comprendiendo cada secuencia oligonucleotídica un segmento V y un segmento J;

ii) un primer conjunto de moldes sintéticos que representan esencialmente todas las combinaciones posibles de segmentos V y segmentos J, donde cada molde sintético del primer conjunto de moldes sintéticos comprende:

(a) una combinación única de un segmento V y un segmento J o C, donde el segmento V es un segmento V de TCR o Ig, y donde el segmento J o C es un segmento J o C de TCR o Ig; y

(b) un código de barras único que identifica dicho molde sintético como sintético;

B) determinar un factor de amplificación para cada molde sintético que comprende una combinación única de un segmento V y un segmento J o C, donde dicho factor de amplificación está representado por el número total de primeros moldes sintéticos amplificados y secuenciados en la etapa A (ii) dividido entre el número total de entrada de los primeros moldes sintéticos únicos introducidos en la etapa A (ii);

C) determinar el número total de linfocitos T o linfocitos B de la muestra dividiendo el número total de secuencias biológicas de salida observadas en la etapa A (i) entre el factor de amplificación de la etapa B;

D) amplificar por PCR multiplexada y secuenciar:

i) una o más regiones de control genómico del ADN obtenido de dicha muestra para obtener un número total de secuencias biológicas de salida para cada región de control genómico; y

ii) un segundo conjunto de moldes sintéticos, donde cada molde sintético del segundo conjunto de moldes sintéticos comprende la secuencia de una o más de dichas secuencias de control genómico, un código de barras único y un tramo de ácidos nucleicos aleatorios, y donde cada molde sintético del segundo conjunto de moldes sintéticos se representa solo una vez;

E) determinar un factor de amplificación para cada una de dichas regiones de control genómico dividiendo el número total de segundos moldes sintéticos amplificados y secuenciados en la etapa D (ii) entre el número total de entrada de los segundos moldes sintéticos únicos introducidos en la etapa D (ii);

F) determinar el número total de genomas de entrada dividiendo el número total de secuencias biológicas de salida para cada región de control genómico de la etapa D (i) entre el factor de amplificación correspondiente para esa región de control genómico de la etapa E; y

G) determinar la proporción de linfocitos T o linfocitos B contenidos en la muestra con respecto al número de genomas totales de la muestra dividiendo el número total de linfocitos T o linfocitos B obtenidos en la etapa C entre el número total de genomas de entrada obtenidos en la etapa F.