Método para medir y calibrar el sesgo de amplificación en reacciones de PCR multiplexadas.

Un método para determinar el potencial de amplificación de ácido nucleico no uniforme entre los miembros de un conjunto de cebadores oligonucleotídicos que es capaz de amplificar moléculas de ácido nucleico reordenadas que codifican uno o más receptores inmunitarios adaptativos en una muestra biológica que comprende moléculas de ácido nucleico reordenadas de células linfoides de sujeto mamífero,

comprendiendo el método:

(a) amplificar una composición que comprende una pluralidad de oligonucleótidos molde utilizando el conjunto de cebadores oligonucleotídicos en una reacción de PCR múltiple para obtener una pluralidad de oligonucleótidos molde amplificados, en donde cada oligonucleótido molde comprende en la dirección 5'-3'

(i) una secuencia oligonucleotídica V que comprende al menos 20 y no más de 1000 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región variable (V) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y comprendiendo cada secuencia oligonucleotídica V una secuencia oligonucleotídica única de la región V y

(ii) una secuencia oligonucleotídica J que comprende al menos 15 y no más de 600 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región de la unión (J) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y comprendiendo cada secuencia oligonucleotídica J una secuencia oligonucleotídica única de la región J ,

y en donde cada oligonucleótido molde comprende adicionalmente una o más secuencias oligonucleotídicas aleatorias, y en donde la pluralidad de oligonucleótidos molde comprende al menos a o al menos b secuencias oligonucleotídicas únicas, la que sea mayor, en donde a es el número de segmentos génico únicos que codifican la región V del receptor inmunitario adaptativo en el sujeto y b es el número de segmentos génicos únicos que codifican la región J del receptor inmunitario adaptativo en el sujeto, y la composición comprende al menos un oligonucleótido molde para cada secuencia oligonucleotídica de región V única y al menos un oligonucleótido molde para cada secuencia oligonucleotídica de región J única;

(b) secuenciar dicha pluralidad de oligonucleótidos molde amplificados para determinar, para cada oligonucleótido molde único que comprende dicha pluralidad,

(i) una secuencia oligonucleotídica molde y

(ii) una frecuencia de aparición de dicha secuencia oligonucleotídica molde; y

(c) comparar la frecuencia de aparición de cada una de dichas secuencias oligonucleotídicas molde con una 35 distribución esperada, en donde dicha distribución esperada se basa en razones molares predeterminadas de dicha pluralidad de oligonucleótidos molde que comprenden dicha composición, y en donde una desviación entre dicha frecuencia de aparición de dichas secuencias oligonucleotídicas molde y dicha distribución esperada indican un potencial de amplificación de ácido nucleico no uniforme entre los miembros del conjunto de cebadores de amplificación oligonucleotídicos.