Detección de variación de nucleótido en una secuencia de ácidos nucleicos diana.

Un método para detectar una variación de nucleótido diana en una secuencia de ácidos nucleicos diana usando un bloqueador de amplificación y un ensayo de VD-PTOCE (Detección de Variación por Escisión y Extensión de PTO),

que comprende:

(a) hibridar la secuencia de ácidos nucleicos diana con un par de cebadores que comprende un cebador cadena arriba y un cebador cadena abajo para amplificación del ácido nucleico diana, bloqueador de amplificación que presenta la resistencia a la escisión por 5' nucleasa y un PTO-NV (Oligonucleótido de Sondeo y Etiquetado para Variación de Nucleótido); en la que cada uno del cebador cadena arriba y el cebador cadena abajo comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos diana; el bloqueador de amplificación comprende una secuencia complementaria a una variación de nucleótido no diana diferente a la variación de nucleótido diana en la secuencia de ácidos nucleicos diana y el PTO-NV comprende (i) una porción de dirección en la posición 3' que comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos diana, (ii) una porción de etiquetado en la posición 5' que comprende una secuencia de nucleótidos no complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos diana, y (iii) un sitio de diferenciación de variación de nucleótido que comprende una secuencia complementaria a la variación de nucleótido diana en el ácido nucleico diana, colocada en una parte en el extremo 5' terminal de la porción de dirección en la posición 3';

en la que el bloqueador de amplificación se hibrida con la secuencia de ácidos nucleicos diana que tiene la variación de nucleótido no diana y no se hibrida con la secuencia de ácidos nucleicos diana que tiene la variación de nucleótido diana; en el que la porción de dirección en la posición 3' del PTO-NV se hibrida con la secuencia de ácidos nucleicos diana y la porción de etiquetado en la posición 5' del PTO-NV no se hibrida con la secuencia de ácidos nucleicos diana;

en el que el cebador cadena arriba se sitúa cadena arriba del PTO-NV; el bloqueador de amplificación se sitúa cadena abajo del cebador cadena arriba o el cebador cadena abajo; y el bloqueador de amplificación y el PTONV se sitúan entre el cebador cadena arriba y el cebador cadena abajo;

(b) poner en contacto el producto resultante de la etapa (a) con una enzima que tiene una actividad de 5' nucleasa en condiciones para la escisión del PTO-NV; en el que el cebador cadena arriba induce a través de su hebra extendida la escisión del PTO-NV por la enzima que tiene la actividad de 5' nucleasa; en el que la hibridación del bloqueador de amplificación con la secuencia de ácidos nucleicos diana que tiene la variación de nucleótido no diana inhibe la extensión del cebador situado cadena arriba del bloqueador de amplificación, bloqueando de ese modo la amplificación de la secuencia de ácidos nucleicos diana que tiene la variación de nucleótido no diana;

en el que cuando el PTO-NV se hibrida con la secuencia de ácidos nucleicos diana que tiene la variación de nucleótido diana complementaria al sitio de diferenciación de variación de nucleótido, la parte en el extremo 5' terminal de la porción de dirección en la posición 3' forma una doble hebra con la secuencia de ácidos nucleicos diana para inducir la escisión desde un primer sitio de escisión inicial y se libera un primer fragmento; en el que cuando el PTO-NV se hibrida con la secuencia de ácidos nucleicos diana que tiene la variación de nucleótido no diana no complementaria al sitio de diferenciación de variación de nucleótido, la parte en el extremo 5' terminal de la porción de dirección en la posición 3' no forma una doble hebra con la secuencia de ácidos nucleicos diana para inducir la escisión desde un segundo sitio de escisión inicial situado cadena abajo del primer sitio de escisión inicial y se libera un segundo fragmento; en el que el segundo fragmento comprende una porción adicional en el extremo en la posición 3' terminal que permite que el segundo fragmento sea diferente al primer fragmento;

(c) hibridar el fragmento liberado del PTO-NV con un CTO (Oligonucleótido de Captura y Formación de Molde); en el que el CTO comprende, en una dirección de la posición 3' a la posición 5' (i) una porción de captura que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la porción de etiquetado en la posición 5' o una parte de la porción de etiquetado en la posición 5' del PTO-NV y (ii) una porción de formación de molde que comprende una secuencia de nucleótidos no complementaria a la porción de etiquetado en la posición 5' y la porción de dirección en la posición 3' del PTO-NV; en el que el primer fragmento o el segundo fragmento liberado del PTO-NV se hibrida con la porción de captura del CTO;

(d) realizar una reacción de extensión usando el producto resultante de la etapa (c) y una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde; en el que cuando el primer fragmento se hibrida con la porción de captura del CTO, se extiende para formar una hebra extendida que comprende una secuencia extendida complementaria a la porción de formación de molde del CTO; en el que cuando el segundo fragmento se hibrida con la porción de captura del CTO, no se extiende; y

(e) detectar la presencia de la hebra extendida, de modo que la presencia de la hebra extendida indica la presencia de la variación de nucleótido diana.