Detección de variación de nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico diana mediante escisión CTO y ensayo de extensión.

Un metodo para detectar una variacion de nucleotidos en una secuencia de acido nucleico diana mediante un ensayo PTOCE (Escision y Extension de Oligonucleotido de Sondaje y Marcaje),

que comprende:

(a) hibridacion de la secuencia de acido nucleico diana con un cebador en direccion 5' y un PTO-NV (Oligonucleotido de Sondaje y Marcaje para Variacion de Nucleotidos); en la que el cebador en direccion 5' comprende una secuencia de nucleotidos de hibridacion complementaria a la secuencia de acido nucleico diana; el PTO-NV comprende (i) un segmento localizador en 3' que comprende una secuencia de nucleotidos de hibridacion complementaria a la secuencia de acido nucleico diana, (ii) un segmento de marcaje en 5' que comprende una secuencia de nucleotidos no complementaria a la secuencia de acido nucleico diana y (iii) un sitio de discriminacion de variacion de nucleotidos, que comprende una secuencia complementaria a la variacion de nucleotidos en el acido nucleico diana, posicionado en una parte del extremo 5' del segmento localizador en 3'; en donde el segmento localizador en 3' se hibrida con la secuencia de acido nucleico diana y el segmento de marcaje en 5' no se hibrida con la secuencia de acido nucleico diana; el cebador en direccion 5' se situa en direccion 5' del PTO-NV; la cadena extendida del cebador en direccion 5' induce la escision del PTO-NV por una polimerasa de acido nucleico dependiente de molde que tiene una actividad nucleasa 5';

(b) puesta en contacto del producto resultante de la etapa (a) con la polimerasa de acido nucleico dependiente de molde que tiene una actividad nucleasa 5' en condiciones para la escision del PTO-NV; en donde cuando el PTO-NV se hibrida con la secuencia de acido nucleico diana que tiene la variacion de nucleotidos complementaria al sitio de discriminacion de variacion de nucleotidos y a la parte del extremo 5' del segmento localizador en 3' forma una cadena doble con la secuencia de acido nucleico diana para inducir la escision de un primer sitio de escision inicial, se libera un primer fragmento; en donde cuando el PTO-NV se hibrida con una secuencia de acido nucleico diana que tiene una variacion de nucleotidos no complementaria al sitio de discriminacion de variacion de nucleotidos y a la parte del extremo 5' del segmento localizador en 3' no forma una cadena doble con la secuencia de acido nucleico diana para inducir la escision de un segundo sitio de escision inicial situado en direccion 3' del primer sitio de escision inicial, se libera un segundo fragmento; en donde el segundo fragmento comprende un segmento del extremo 3' adicional permitiendo que el segundo fragmento se diferencie del primer fragmento;

(c) hibridacion del fragmento liberado del PTO-NV con un CTO (Oligonucleotido de Captura y Molde); en donde el CTO comprende en una direccion de 3' a 5' (i) un segmento de captura que comprende una secuencia de nucleotidos complementaria al segmento de marcaje en 5' o a una parte del segmento de marcaje en 5' del PTONV y (ii) un segmento molde que comprende una secuencia de nucleotidos no complementaria al segmento de marcaje en 5' y al segmento localizador en 3' del PTO-NV; en donde el primer fragmento o el segundo fragmento liberados del PTO-NV se hibridan con el segmento de captura del CTO;

(d) realizacion de una reaccion de extension usando el producto resultante de la etapa (c) y una polimerasa de acido nucleico dependiente de molde; en donde cuando el primer fragmento se hibrida con el segmento de captura del CTO, se extiende para formar una cadena extendida que comprende una secuencia extendida complementaria al segmento molde del CTO; en donde cuando el segundo fragmento se hibrida con el segmento de captura del CTO, no se extiende; y

(e) deteccion de la presencia de la cadena extendida, por lo que la presencia de la cadena extendida indica la presencia de la variacion de nucleotidos complementaria al sitio de discriminacion de nucleotidos del PTO-NV.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/KR2013/001492.

Solicitante: SEEGENE, INC..

Nacionalidad solicitante: República de Corea.

Dirección: 8Fl, 9Fl Taewon Bldg. 65-5, Bangi-dong Songpa-gu Seoul 138-050 REPUBLICA DE COREA.

Inventor/es: LEE,YOUNG JO, CHUN,Jong-Yoon.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/11 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N33/50 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
  • G01N33/58 G01N 33/00 […] › en los que intervienen sustancias marcadas (G01N 33/53 tiene prioridad).

PDF original: ES-2669244_T3.pdf

 

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