Detección de variación de nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico diana mediante escisión CTO y ensayo de extensión.

Un metodo para detectar una variacion de nucleotidos en una secuencia de acido nucleico diana mediante un ensayo PTOCE (Escision y Extension de Oligonucleotido de Sondaje y Marcaje),

que comprende:

(a) hibridacion de la secuencia de acido nucleico diana con un cebador en direccion 5' y un PTO-NV (Oligonucleotido de Sondaje y Marcaje para Variacion de Nucleotidos); en la que el cebador en direccion 5' comprende una secuencia de nucleotidos de hibridacion complementaria a la secuencia de acido nucleico diana; el PTO-NV comprende (i) un segmento localizador en 3' que comprende una secuencia de nucleotidos de hibridacion complementaria a la secuencia de acido nucleico diana, (ii) un segmento de marcaje en 5' que comprende una secuencia de nucleotidos no complementaria a la secuencia de acido nucleico diana y (iii) un sitio de discriminacion de variacion de nucleotidos, que comprende una secuencia complementaria a la variacion de nucleotidos en el acido nucleico diana, posicionado en una parte del extremo 5' del segmento localizador en 3'; en donde el segmento localizador en 3' se hibrida con la secuencia de acido nucleico diana y el segmento de marcaje en 5' no se hibrida con la secuencia de acido nucleico diana; el cebador en direccion 5' se situa en direccion 5' del PTO-NV; la cadena extendida del cebador en direccion 5' induce la escision del PTO-NV por una polimerasa de acido nucleico dependiente de molde que tiene una actividad nucleasa 5';

(b) puesta en contacto del producto resultante de la etapa (a) con la polimerasa de acido nucleico dependiente de molde que tiene una actividad nucleasa 5' en condiciones para la escision del PTO-NV; en donde cuando el PTO-NV se hibrida con la secuencia de acido nucleico diana que tiene la variacion de nucleotidos complementaria al sitio de discriminacion de variacion de nucleotidos y a la parte del extremo 5' del segmento localizador en 3' forma una cadena doble con la secuencia de acido nucleico diana para inducir la escision de un primer sitio de escision inicial, se libera un primer fragmento; en donde cuando el PTO-NV se hibrida con una secuencia de acido nucleico diana que tiene una variacion de nucleotidos no complementaria al sitio de discriminacion de variacion de nucleotidos y a la parte del extremo 5' del segmento localizador en 3' no forma una cadena doble con la secuencia de acido nucleico diana para inducir la escision de un segundo sitio de escision inicial situado en direccion 3' del primer sitio de escision inicial, se libera un segundo fragmento; en donde el segundo fragmento comprende un segmento del extremo 3' adicional permitiendo que el segundo fragmento se diferencie del primer fragmento;

(c) hibridacion del fragmento liberado del PTO-NV con un CTO (Oligonucleotido de Captura y Molde); en donde el CTO comprende en una direccion de 3' a 5' (i) un segmento de captura que comprende una secuencia de nucleotidos complementaria al segmento de marcaje en 5' o a una parte del segmento de marcaje en 5' del PTONV y (ii) un segmento molde que comprende una secuencia de nucleotidos no complementaria al segmento de marcaje en 5' y al segmento localizador en 3' del PTO-NV; en donde el primer fragmento o el segundo fragmento liberados del PTO-NV se hibridan con el segmento de captura del CTO;

(d) realizacion de una reaccion de extension usando el producto resultante de la etapa (c) y una polimerasa de acido nucleico dependiente de molde; en donde cuando el primer fragmento se hibrida con el segmento de captura del CTO, se extiende para formar una cadena extendida que comprende una secuencia extendida complementaria al segmento molde del CTO; en donde cuando el segundo fragmento se hibrida con el segmento de captura del CTO, no se extiende; y

(e) deteccion de la presencia de la cadena extendida, por lo que la presencia de la cadena extendida indica la presencia de la variacion de nucleotidos complementaria al sitio de discriminacion de nucleotidos del PTO-NV.