Método para amplificar selectivamente una secuencia diana de ácidos nucleicos a partir de un ADN o de una mezcla de ácidos nucleicos,

que comprende amplificar la secuencia diana de ácidos nucleicos llevando a cabo por lo menos dos ciclos de hibridación de cebadores, extensión de cebadores y desnaturalización, utilizando un conjunto de cebadores que comprende una pareja de oligonucleótidos de doble especificidad con especificidad de hibridación incrementada, en el que cada oligonucleótido de doble especificidad se encuentra representado por la fórmula general siguiente:

5'-Xp-Yq-Zr-3'

en la que Xp representa una parte 5' de especificidad a Tm elevada que presenta una secuencia de nucleótidos hibridante sustancialmente complementaria a un sitio de un ácido nucleico molde para permitir la hibridación con el mismo; Yq representa una parte de separación que comprende por lo menos tres bases universales contiguas; Zr representa una parte 3' de especificidad a Tm reducida que presenta una secuencia de nucleótidos hibridante sustancialmente complementaria a un sitio del ácido nucleico molde para permitir la hibridación con el mismo; p, q y r representan el número de nucleótidos y p representa un número entero igual o superior a 15; q representa un número entero igual o superior a 3 y r representa un número entero igual o superior a 3; y X, Y y Z son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos; la Tm de la parte 5' de especificidad a Tm elevada es superior a la de la parte 3' de especificidad a Tm reducida, la parte de separación presenta la Tm más baja de las tres partes; la parte 5' de especificidad a Tm elevada es más larga que la parte 3' de especificidad a Tm reducida; la parte de separación forma un tramo en el que no se aparean las bases, que no sirve como sitio de hibridación y que no interactúa con el molde para el apareamiento de bases, bajo condiciones en las que la parte 5' de especificidad a Tm elevada y la parte 3' de especificidad a Tm reducida se hibridan con el ácido nucleico molde, permitiendo que la parte 5' de especificidad a Tm elevada se diferencie de la parte 3' de especificidad a Tm reducida en términos de especificidad de hibridación con el ácido nucleico molde, en donde la especificidad de hibridación del oligonucleótido se determina dualmente a partir de la parte 5' de especificidad a Tm elevada y la parte 3' de especificidad a Tm reducida de manera que la especificidad de hibridación global del oligonucleótido resulta incrementada; en donde la hibridación de la reacción de amplificación se lleva a cabo bajo condiciones en las que no se produce la hibridación únicamente con la parte 3' de especificidad a Tm reducida, en el que un primer y segundo ciclos de la reacción de amplificación implican la hibridación de tanto la parte 5' de especificidad a Tm elevada como la parte 3' de especificidad a Tm reducida de la parte dual y de la parte 3' de especificidad a Tm reducida del oligonucleótido de doble especificidad con la secuencia diana de ácidos nucleicos, y los ciclos posteriores de la reacción de amplificación implican la hibridación de tanto la parte 5' de especificidad a Tm elevada como la parte 3' de especificidad a Tm reducida del oligonucleótido de doble especificidad con una secuencia derivada del oligonucleótido de doble especificidad incorporado en el producto amplificado, en el que la base universal contenida en la parte de separación es desoxiinosina o inosina.

Procedimientos que utilizan un oligonucleótido de doble especificidad y oligonucleótido de doble especificidad para los mismos

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a diversos procedimientos que utilizan un oligonucleótido de doble especificidad y a un oligonucleótido de doble especificidad para los mismos. Más concretamente, la presente invención se refiere a diversos procedimientos mediante una reacción de extensión dependiente de molde que utiliza un oligonucleótido de doble especificidad y a un oligonucleótido de doble especificidad para la misma.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA

La amplificación de ácidos nucleicos es un proceso crucial para una amplia diversidad de métodos de la biología molecular, de modo que se han propuesto diversos métodos de amplificación. Por ejemplo, Miller H.I. et al. (patente WO nº 89/06700) amplificaron una secuencia de ácidos nucleicos basándose en la hibridación de un promotor/secuencia de cebador con un ADN monocatenario diana (“ADNmc”) seguido de la transcripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Entre otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos se incluyen los sistemas de amplificación basados en la transcripción (Kwoh D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:1173, 1989; y Gingeras T.R. et al., patente WO nº 88/10315) .

El procedimiento más predominante para la amplificación de ácidos nucleicos conocido como reacción en cadena de la polimerasa (en lo sucesivo de nominado “PCR”) se basa en ciclos repetidos de desnaturalización del ADN de doble cadena, seguido de la hibridación de un cebador oligonucleótido al molde de ADN, y la extensión del cebador por parte de una ADN polimerasa (Mullis et al., patentes US nº 4.683.195, nº 4.683.202 y nº 4.800.159; Saiki et al., Science 230:1350-1354, 1985) . Los cebadores oligonucleótidos utilizados en la PCR están diseñados para hibridarse a cadenas opuestas del ADN molde. Los cebadores son extendidos por la ADN polimerasa, a partir de la que el producto de un cebador puede servir como cadena molde para el otro cebador en reacciones posteriores. El procedimiento de amplificación por PCR resulta en el incremento exponencial de fragmentos discretos de ADN cuya longitud está definida por los extremos 5' de los cebadores oligonucleótidos.

El éxito de las amplificaciones de ácidos nucleicos, en particular la amplificación por PCR, se basa en la especificidad con la que un cebador se hibrida únicamente a su secuencia diana (y no a secuencias no diana) ; por lo tanto, resulta importante optimizar esta interacción molecular. Que un cebador pueda hibridarse únicamente a su complemento perfecto o también a secuencias que presentan uno o más desapareamientos depende críticamente de la temperatura de hibridación. En general, una temperatura de hibridación más alta conducirá a una hibridación más específica del cebador con su molde perfectamente correspondiente, lo que a su vez incrementará la probabilidad de amplificar únicamente la secuencia diana. Por otra parte, puede tolerarse un número mayor de no correspondencias entre el molde y el cebador a temperaturas de hibridación más bajas. En consideración a este fenómeno, el ajuste de la temperatura de hibridación puede alterar la especificidad de apareamiento entre molde y cebador. Por ejemplo, en el caso de que no haya producto, la temperatura puede ser excesivamente alta para la hibridación. En el caso de existir varios productos de diferente tamaño en donde únicamente se encuentre presente un cebador, lo anterior indica que el cebador único se está hibridando con más de una región del molde. En este caso, debería incrementarse la temperatura de hibridación.

Además de la temperatura de hibridación, para determinar la especificidad de hibridación del cebador deben considerarse varios “parámetros de búsqueda de cebador”, tales como longitud de cebador, el contenido de GC y la longitud del producto de PCR. Un cebador que satisfaga todos estos parámetros resultará en una mejora significativa de la especificidad de hibridación del cebador durante la amplificación del ADN diana, resolviendo simultáneamente los problemas de fondos y productos no específicos derivados de los cebadores utilizados en los experimentos. Es habitual que unos cebadores bien diseñados ayuden a evitar la hibridación y niveles de fondo no específicos, así como a distinguir entre los ADNc o moldes genómicos en la PCR de ARN.

Se han desarrollado muchos enfoques para mejorar la especificidad de hibridación de los cebadores y por lo tanto para conseguir la amplificación del producto deseado. Son ejemplos la PCR “touchdown” (Don et al., Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification, Nucleic Acids Res. 19:4008, 1991) , la PCR de inicio en caliente (Daquila et al., Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating. Nucleic Acids Res. 19:3749, 1991) , PCR anidada (Mullis y Faloona, Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalized chain reaction. Methods Enzymol. 155:335-350, 1987) y la PCR “booster” (Ruano et al., Biphasic amplification of ver y dilute DNA samples via booster PCR. Nucleic Acids Res. 17, 540, 1989) . También se ha informado de que en otros enfoques alternativos diversos compuestos “intensificadores” pueden mejorar la especificidad de la PCR. Entre los compuestos intensificadores se incluyen compuestos químicos que incrementan la temperatura de hibridación efectiva de la reacción, proteínas de unión al ADN y reactivos disponibles comercialmente. Sin embargo, no existe ningún aditivo “mágico” que garantice el éxito de todas las PCR y resulta muy laborioso someter a ensayo diferentes aditivos bajo diferentes condiciones, tales como la temperatura de hibridación. Aunque estos enfoques han contribuido en algunos casos a la mejora de la especificidad de hibridación de los cebadores, no han accedido fundamentalmente a una solución a los problemas planteados por los cebadores utilizados en la amplificación de PCR, tales como productos no específicos y niveles de fondo elevados.

Las técnicas basadas en la PCR han sido utilizadas ampliamente no sólo para la amplificación de una secuencia de ADN diana, sino también para aplicaciones o métodos científicos en los campos de la investigación biológica y médica, tales como la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) , PCR de expresión diferencial (DD-PCR) , clonación de genes conocidos o desconocidos mediante PCR, amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) , PCR de cebado arbitrario (AP-PCR) , PCR multiplex, tipado genómico de SNP y análisis genómico basado en la PCR (McPherson y Moller, PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, NY, 2000) .

Tal como se ha indicado anteriormente, todos estos métodos y técnicas que incluyen amplificación de ácidos nucleicos, notablemente la amplificación por PCR, no están completamente libres de las limitaciones y problemas, resultando de la no especificidad de los cebadores utilizados en cada método, tales como falsos positivos, pobre reproducibilidad, niveles de fondo elevados, aunque se han introducido continuamente enfoques mejorados en cada método. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de nuevos cebadores y métodos para mejorar la especificidad de hibridación, que pueda dar lugar a resultados de amplificación reales.

La hibridación de ADN sigue siendo un procedimiento fundamental de la biología molecular, y se ve afectado por la fuerza iónica, la composición de bases, la longitud de fragmento al que haya sido reducido el ácido nucleico, el grado de desapareamiento y la presencia de agentes desnaturalizantes. Las tecnologías basadas en la hibridación del ADN son una herramienta muy útil en la determinación de secuencias de ácidos nucleicos específicos y resultan claramente valiosas en el diagnóstico útil, en la investigación genética y en el análisis de laboratorio forense. Por ejemplo, Wallace y colaboradores han demostrado que diferencias de secuencia tan sutiles como un único cambio de base resultan suficientes para permitir la discriminación de oligómeros cortos (por ejemplo 14-meros) y han demostrado cómo podría aplicarse al análisis molecular de mutaciones puntuales en el gen de la $ -globina (Wallace B.R. et al., The use of synthetic oligonucleotides as hybridization probes. Hybridization of oligonucleotides of mixed sequence to rabbit $-globin DNA. Nucleic Acids Res. 9:879-894, 1981; y Conner, B.J., et al. Detection... [Seguir leyendo]

1. Método para amplificar selectivamente una secuencia diana de ácidos nucleicos a partir de un ADN o de una mezcla de ácidos nucleicos, que comprende amplificar la secuencia diana de ácidos nucleicos llevando a cabo por lo menos dos ciclos de hibridación de cebadores, extensión de cebadores y desnaturalización, utilizando un conjunto de cebadores que comprende una pareja de oligonucleótidos de doble especificidad con especificidad de hibridación incrementada, en el que cada oligonucleótido de doble especificidad se encuentra representado por la fórmula general siguiente:

5'-Xp-Yq-Zr-3'

en la que Xp representa una parte 5' de especificidad a Tm elevada que presenta una secuencia de nucleótidos hibridante sustancialmente complementaria a un sitio de un ácido nucleico molde para permitir la hibridación con el mismo; Yq representa una parte de separación que comprende por lo menos tres bases universales contiguas; Zr representa una parte 3' de especificidad a Tm reducida que presenta una secuencia de nucleótidos hibridante sustancialmente complementaria a un sitio del ácido nucleico molde para permitir la hibridación con el mismo; p, q y r representan el número de nucleótidos y p representa un número entero igual o superior a 15; q representa un número entero igual o superior a 3 y r representa un número entero igual o superior a 3; y X, Y y Z son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos; la Tm de la parte 5' de especificidad a Tm elevada es superior a la de la parte 3' de especificidad a Tm reducida, la parte de separación presenta la Tm más baja de las tres partes; la parte 5' de especificidad a Tm elevada es más larga que la parte 3' de especificidad a Tm reducida; la parte de separación forma un tramo en el que no se aparean las bases, que no sirve como sitio de hibridación y que no interactúa con el molde para el apareamiento de bases, bajo condiciones en las que la parte 5' de especificidad a Tm elevada y la parte 3' de especificidad a Tm reducida se hibridan con el ácido nucleico molde, permitiendo que la parte 5' de especificidad a Tm elevada se diferencie de la parte 3' de especificidad a Tm reducida en términos de especificidad de hibridación con el ácido nucleico molde, en donde la especificidad de hibridación del oligonucleótido se determina dualmente a partir de la parte 5' de especificidad a Tm elevada y la parte 3' de especificidad a Tm reducida de manera que la especificidad de hibridación global del oligonucleótido resulta incrementada; en donde la hibridación de la reacción de amplificación se lleva a cabo bajo condiciones en las que no se produce la hibridación únicamente con la parte 3' de especificidad a Tm reducida, en el que un primer y segundo ciclos de la reacción de amplificación implican la hibridación de tanto la parte 5' de especificidad a Tm elevada como la parte 3' de especificidad a Tm reducida de la parte dual y de la parte 3' de especificidad a Tm reducida del oligonucleótido de doble especificidad con la secuencia diana de ácidos nucleicos, y los ciclos posteriores de la reacción de amplificación implican la hibridación de tanto la parte 5' de especificidad a Tm elevada como la parte 3' de especificidad a Tm reducida del oligonucleótido de doble especificidad con una secuencia derivada del oligonucleótido de doble especificidad incorporado en el producto amplificado, en el que la base universal contenida en la parte de separación es desoxiinosina o inosina.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la hibridación se lleva a cabo a una temperatura de entre 45º C y 68º C.

3. Método según la reivindicación 1, en el que la reacción de amplificación es una reacción en cadena de la polimerasa.

4. Método según la reivindicación 1, en el que la parte 3' de especificidad a Tm reducida presenta la secuencia de nucleótidos hibridante perfectamente complementaria al sitio del ácido nucleico molde para permitir la hibridación con el mismo.

5. Método según la reivindicación 1, en el que p representa un número entero entre 15 y 40.

6. Método según la reivindicación 5, en el que p representa un número entero entre 15 y 25.

7. Método según la reivindicación 1, en el que q representa un número entero entre 3 y 10.

8. Método según la reivindicación 1, en el que r representa un número entero entre 3 y 15.

9. Método según la reivindicación 1, en el que p es un número entero entre 15 y 25, q es un número entero entre 3 y 10, y r es un número entero entre 3 y 15.

10. Método según la reivindicación 1, en el que la Tm de la parte 5' de especificidad a Tm elevada es de entre 40º C y 80º C.

11. Método según la reivindicación 1, en el que la Tm de la parte 3' de especificidad a Tm reducida es de entre 10º C y 40º C.

12. Método según la reivindicación 1, en el que la Tm de la parte de separación es de entre 3º C y 15º C.

13. Método según la reivindicación 1, en el que la secuencia diana de ácidos nucleicos comprende dos o más secuencias diana de ácidos nucleicos y el conjunto de cebadores comprende dos o más conjuntos de cebadores para la amplificación multiplex.