Detección de una secuencia de ácido nucleico diana mediante ensayo sin hibridación dependiente de escisión y extensión de PTO.

Método para detectar una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra de ácido nucleico mediante un ensayo PCE-NH (sin hibridación dependiente de escisión y extensión de PTO),

que comprende:

(a) hibridar la secuencia de ácido nucleico diana con un oligonucleótido en el sentido de 5' y un PTO (oligonucleótido de estudio con sonda y etiquetado); en el que el oligonucleótido en el sentido de 5' comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; el PTO comprende (i) una porción de direccionamiento en 3' que comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana y (ii) una porción de etiquetado en 5' que comprende una secuencia de nucleótidos no complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; en el que la porción de direccionamiento en 3' se hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana y la porción de etiquetado en 5' no se hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana; el oligonucleótido en el sentido de 5' está ubicado en el sentido de 5' del PTO;

(b) poner en contacto el resultante de la etapa (a) con una enzima que tiene una actividad nucleasa 5' en condiciones para la escisión del PTO; en el que el oligonucleótido en el sentido de 5' o su cadena extendida induce la escisión del PTO mediante la enzima que tiene la actividad nucleasa 5' de manera que la escisión libera un fragmento que comprende la porción de etiquetado en 5' o una parte de la porción de etiquetado en 5' del PTO;

(c) hibridar el fragmento liberado del PTO con un CTO (oligonucleótido de captura y formación de molde); en el que el CTO comprende en una dirección de 3' a 5' (i) una porción de captura que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la porción de etiquetado en 5' o una parte de la porción de etiquetado en 5' del PTO y (ii) una porción de formación de molde que comprende una secuencia de nucleótidos no complementaria a la porción de etiquetado en 5' y la porción de direccionamiento en 3' del PTO; en el que el fragmento liberado del PTO se hibrida con la porción de captura del CTO;

(d) realizar una reacción de extensión usando el resultante de la etapa (c) y una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde; en el que el fragmento hibridado con la porción de captura del CTO se extiende para producir una cadena extendida complementaria a la porción de formación de molde del CTO y se forma un dúplex extendido; en el que cuando la secuencia de ácido nucleico diana no está presente en la muestra de ácido nucleico, no se forma el dúplex extendido;

(e) realizar un análisis de fusión o un análisis de hibridación para el resultante de la etapa (d) a lo largo de un intervalo de temperaturas con un HO (oligonucleótido de hibridación) que comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria al CTO; en el que cuando la secuencia de ácido nucleico diana no está presente en la muestra de ácido nucleico, no se forma el dúplex extendido y el CTO y el HO forman un híbrido, proporcionando de ese modo una señal indicativa de la presencia del híbrido entre el CTO y el HO; en el que cuando la secuencia de ácido nucleico diana está presente en la muestra de ácido nucleico, se forma el dúplex extendido para impedir la formación del híbrido entre el CTO y el HO, no proporcionando de ese modo la señal; en el que la señal se proporciona mediante (i) un marcador unido al HO, (ii) un marcador unido al CTO, (iii) un marcador unido al HO y un marcador unido al CTO, o (iv) un marcador de intercalación; y

(f) detectar la señal indicativa de la presencia del híbrido entre el CTO y el HO; en el que la presencia del híbrido entre el CTO y el HO indica la ausencia de la secuencia de ácido nucleico diana; en el que la ausencia del híbrido entre el CTO y el HO indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/KR2013/012312.

Solicitante: SEEGENE, INC..

Nacionalidad solicitante: República de Corea.

Dirección: 8Fl. 9Fl. 91 Ogeum-ro Songpa-gu Seoul 138-828 REPUBLICA DE COREA.

Inventor/es: LEE,YOUNG JO, CHUN,Jong-Yoon.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/11 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2653642_T3.pdf

 

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