Procedimientos de detección de diana con cebador HDD.

Un procedimiento de detección de una secuencia de ácido nucleico diana de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos usando una reacción de escisión en 5' y una reacción de extensión en 3' de un cebador de hibridación y detección de la diana (cebador HDD),

que comprende las etapas de:

(a) hibridar la secuencia de ácido nucleico diana con el cebador HDD, en el que el cebador HDD comprende (i) hibridar una secuencia nucleotídica complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana y (ii) un marcador o un sistema marcador interactivo que contiene una pluralidad de marcadores;

(b) poner en contacto el resultante de la etapa (a) con una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde que tiene una actividad nucleasa de 5' a 3' en las condiciones de la reacción de escisión en 5' y la reacción de extensión en 3' del cebador HDD mediante el ácido nucleico polimerasa dependiente de molde; en el que el cebador HDD se extiende por acción de la actividad polimerasa de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde y es escindido por la actividad nucleasa de 5' a 3' del ácido nucleico polimerasa dependiente de molde para liberar el marcador, o al menos un marcador del sistema marcador interactivo del cebador HDD, de modo que se obtiene una señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana; y

(c) detectar la señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.

Procedimientos de detección de diana con cebador HDD Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a la detección de una secuencia de ácido nucleico diana usando un cebador de hibridación y detección de dianas (HDD)

Descripción de la técnica relacionada

Un proceso de amplificación de ácido nucleico diana está implicado predominantemente en la mayoría de las tecnologías para la detección de secuencias de ácido nucleico diana. La amplificación de ácido nucleico es un proceso fundamental para una amplia variedad de procedimientos en biología molecular, de tal forma que se han propuesto vahos procedimientos de amplificación. Por ejemplo, Miller, H. I. y col., (WO 89/67) amplificaron una de secuencia de ácido nucleico en base a la hibridación de una secuencia cebadora/promotora a un ADN monocatenario ("ssADN") diana, seguido de transcripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico conocidos incluyen sistemas de amplificación basados en la transcripción (Kwoh, D. y col., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 86:1173(1989); y Gingeras TR. y col., WO 88/1315).

El proceso más predominante para la amplificación de ácidos nucleicos conocido como reacción en cadena de la polimerasa (en lo sucesivo denominado en el presente documento POR) se basa en ciclos repetidos de desnaturalización de ADN bicatenario seguido de hibridación del cebador oligonucleotídico al molde de ADN y extensión del cebador mediante una ADN polimerasa (Mullís y col., patentes de EE.UU. N° 4.683.195, 4.683.22, Y 4.8.159; Saiki et al., (1985) Science 23, 135 - 1354).

Las técnicas basadas en PCR se han usado ampliamente, no solo para la amplificación de una secuencia de ADN diana sino también para aplicaciones científicas o procedimientos en los campos de investigación biológica y médica, tal como PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR), PCR de expresión diferencial (DD-PCR), clonación de genes conocidos o desconocidos mediante PCR, amplificación rápida de los extremos ADNc (RACE), PCR con cebado arbitrario (AP-PCR), PCR multiplexada, tipado del genoma de SNP y análisis genómico basado en PCR (McPherson y Moller, (2) PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlín Heidelberg, NY).

A continuación, se resumen procedimientos para detectar ácidos nucleicos diana basados en la amplificación de ácidos nucleicos propuesta hasta ahora, del siguiente modo:

1. Procedimiento de detección post-PCR

El procedimiento post-PCR que normalmente es heterogéneo implica amplificación de ácido nucleico y, después, detección de los productos amplificados para analizar la secuencia del ácido nucleico diana. El procedimiento de detección post-PCR convencional requiere separar los productos amplificados en base a un diferencial de tamaño, que normalmente se consigue mediante el uso de electroforesis en gel, o a través de la inmovilización del producto. No obstante, el proceso de separación produce problemas serios, tales como contaminación de arrastre y bajo rendimiento.

2. Procedimientos de detección en tiempo real

Para superar los problemas del procedimiento post-PCR se sugirió un procedimiento de PCR en tiempo real para detectar los productos amplificados de un modo en tiempo real y con ausencia de contaminantes, lo que perite analizar de forma cuantitativa las secuencias del ácido nucleico diana.

2.1 Procedimientos que usan reacciones de hibridación v extensión

2.1.1 Procedimiento con cebadores Sunrise

Este procedimiento usa cebadores de tipo Sunrise que forman bucles en horquilla en sus extremos 5 para acercar un par de fluoróforo e ¡nactivador de modo que se garantiza una baja fluorescencia. Cuando estos cebadores se incorporan en un producto de PCR, las colas se convierten en bicatenarias y la horquilla se desenreda, lo que hace que la fluorescencia aumente (Nazarenko et al, 2516 - 2521 Nucleic Acids Research, 1997, v. 25 N° 12 y patente de EE.UU. N° 6.117.635). No obstante, el procedimiento con cebadores Sunrise es muy inconveniente en cuanto a que los cebadores están diseñados de un modo muy elaborado para que contengan una secuencia complementaria a las secuencias del ácido nucleico diana y una secuencia capaz de formar bucles de horquilla en sus extremos 5.

2.1.2 Procedimiento del cebador en cola (procedimiento del cebador Scorpion)

Este procedimiento usa un cebador con cola (cebador Scorpion) y un sistema de señalización integrado El cebador tiene una región de unión al molde y la cola que comprende un enlazador y una región de unión a la diana. La región de unión a la diana híbrida con una secuencia complementaria en un producto de extensión del cebador. Después,

este acontecimiento de hibridación específica de diana se acopla a un sistema de señalización en el que la hibridación conduce a un cambio detectable. El enlazador en el cebador con cola impide la copia de la cadena mediada por la polimerasa de la región de cola del molde del cebador (Whitcombe y col., 84 - 87, Nature Biotechnology v.17 AUGUST 1999 y patente de EE UU. N° 6.326.145). Como el procedimiento del cebador Sunrise, este cebador con cola también tiene una dificultad por el diseño y síntesis de los cebadores debido a la incorporación de un enlazador para generar señales dependientes de amplicón y una región de unión a la diana que puede hibridar con un producto de extensión del cebador en un cebador.

2.2 Procedimientos que usan reacciones de hibridación

2.2.1 Procedimiento con balizas moleculares

Las balizas moleculares contienen pigmentos fluorescentes y de inactivación, pero solo se produce FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) cuando el pigmento inactivador es directamente adyacente al pigmento fluorescente. Las balizas moleculares están diseñadas para adoptar una estructura de horquilla cuando están libres en solución de modo que hace que ambos pigmentos se acerquen considerablemente. Cuando una baliza molecular híbrida con una diana se separan los pigmentos fluorescente e inactivador. La FRET no se produce y el pigmento fluorescente emite luz tras la irradiación (Indian J Med Res 124: 385 - 398(26) y Tyagiycol., Nature Biotechnology v. 14 MARCH 1996).

No obstante, hay algunos inconvenientes en el procedimiento con balizas moleculares.

En primer lugar, las dos repeticiones invertidas de la estructura en horquilla deben tener homólogos complementarios en el ácido nucleico diana, que a su vez requiere la presencia de repeticiones invertidas en la diana también, una condición que normalmente no se cumple.

En segundo lugar, la Tm de la porción en bucle de la estructura en horquilla con una secuencia de ácido nucleico complementaria y la Tm de la porción principal tiene que equilibrarse cuidadosamente con respecto a la temperatura del ensayo para permitir el desplegamiento específico de la sonda en horquilla en presencia de la diana sin un desplegamiento ¡nespecífico.

Por último, este procedimiento demanda cebadores adicionales para amplificar las secuencias de ácidos nucleicos diana.

2.2.2 Procedimientos de sondas de hibridación

Este procedimiento usa cuatro oligonucleótidos: dos cebadores y dos sondas. Las sondas de hibridación tienen un único marcador, uno con un fluoróforo donante y uno con un fluoróforo aceptor. La secuencia de las dos sondas se selecciona de forma que pueden hibridar con las secuencias diana en una disposición cabeza-cola, acercando mucho los pigmentos TOW, lo que permite que se produzca la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). El pigmento aceptor en una de las sondas transfiere energía, lo que permite que el otro disipe fluorescencia a una longitud de onda diferente. La cantidad de fluorescencia es directamente proporcional a la cantidad de ADN diana generada durante el proceso de PCR (385 - 398, Indian J Med Res 124, artículo de revisión, octubre 26 y 33 - 38, y Bernad y col., 147 - 148 Clin Chem 2; 46).

No obstante, este procedimiento no lo puede adoptar la detección multiplexada y requiere cebadores adicionales para amplificar la secuencias del ácido nucleico diana.

2.3 Procedimientos que usan hibridación v actividad nucleasa

2.3.1 Procedimiento con la sonda TaqMan (actividad nucleasa 5' a 3')

Las sondas TaqMan están diseñadas para hibridar con una región interna de un producto de PCR. Durante la PCR, cuando la polimerasa replica un molde sobre el que se ha unido una sonda TaqMan, la actividad exonucleasa 5 de la polimerasa escinde la sonda. Esto separa los pigmentos fluorescente e inactivador y no se sigue produciendo la FRET (385 - 398, Indian J Med Res 124, artículo... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de detección de una secuencia de ácido nucleico diana de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos usando una reacción de escisión en 5 y una reacción de extensión en 3' de un cebador de hibridación y detección de la diana (cebador HDD), que comprende las etapas de:

(a) hibridar la secuencia de ácido nucleico diana con el cebador HDD, en el que el cebador HDD comprende (i) hibridar una secuencia nucleotídica complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana y (ii) un marcador o un sistema marcador interactivo que contiene una pluralidad de marcadores;

(b) poner en contacto el resultante de la etapa (a) con una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde que tiene una actividad nucleasa de 5 a 3 en las condiciones de la reacción de escisión en 5 y la reacción de extensión en 3 del cebador HDD mediante el ácido nucleico polimerasa dependiente de molde; en el que el cebador HDD se extiende por acción de la actividad polimerasa de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde y es escindido por la actividad nucleasa de 5' a 3' del ácido nucleico polimerasa dependiente de molde para liberar el marcador, o al menos un marcador del sistema marcador interactivo del cebador HDD, de modo que se obtiene una señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana; y

(c) detectar la señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende además la etapa de repetir las etapas (a)-(b) o (a)-(c) con desnaturalización entre ciclos repetidos al menos dos veces para amplificar la señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el cebador HDD usado tiene una estructura de oligonucleótido de cebado doble (OCD) representada por la siguiente fórmula general I o una estructura de oligonucleótido de especificidad doble modificado (OEDm) representada por la siguiente fórmula general II:

5'-XP-Yq-Zr3' (I)

en la que Xp representa una primera porción de cebado en 5 que tiene una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; Yq representa una porción de separación que comprende al menos tres bases universales, Zr representa una segunda porción de cebado en 3' que tiene una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; p, q y r representan el número de nucleótidos, y X, Y y Z son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos; la Tm de la primera porción de cebado en 5 es más alta que la de la segunda porción de cebado en 3' y la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones; la porción de separación separa la primera porción de cebado en 5 de la segunda porción de cebado en 3' en términos de acontecimientos de hibridación al ácido nucleico diana, de modo que la especificidad de la hibridación del oligonucleótido viene determinada doblemente por la primera porción de cebado en 5 y la segunda porción de cebado en 3' de forma que la especificidad de hibridación global del cebador HDD es potenciada;

S'-X'p-Y'q-Z'rS' (||)

en la que X'p representa una primera porción de cebado en 5 que tiene una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; Y'q representa una porción de separación que comprende al menos tres bases universales, Z'r representa una segunda porción de cebado en 3' que tiene una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; p, q y r representan el número de nucleótidos, y X1, Y1 y Z' son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos; la Tm de la primera porción de cebado en 5 es inferior a la de la segunda porción de cebado en 3' y la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones de X'p, Y'q and Z'r; la porción de separación separa la segunda porción de cebado en 5 de la primera porción de cebado en 3' en términos de acontecimientos de hibridación al ácido nucleico diana, estando la especificidad de la hibridación del oligonucleótido determinada doblemente por la primera porción de cebado en 5 y la segunda porción de cebado en 3', de forma que la especificidad de hibridación global del cebador HDD se potencia.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el cebador HDD comprende al menos un marcador en su porción terminal en 5.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el cebador HDD comprende al menos un marcador en su extremo 5.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el sistema marcador interactivo es un par de una molécula indicadora fluorescente y una molécula inactivadora colocada en el cebador HDD para inactivar la fluorescencia de la molécula indicadora y los dos cebadores están separados por un sitio dentro del cebador HDD susceptible a la escisión por nucleasa, de modo que permite que la actividad nucleasa de 5' a 3' de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde separe la molécula indicadora fluorescente de la molécula inactivadora escindiendo en el sitio susceptible, obteniendo de este modo la señal indicativa de la presencia de la secuencia de

ácido nucleico diana.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la molécula indicadora fluorescente es localizada en la porción terminal en 5 del cebador HDD y la molécula ¡nactivadora es localizada en 3 de la molécula indicadora fluorescente.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la molécula ¡nactivadora es localizada en la porción terminal en 5 del cebador HDD y la molécula indicadora fluorescente es localizada en 3 de la molécula ¡nactivadora.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico diana comprende al menos dos tipos de secuencias de ácido nucleico y el cebador HDD comprende al menos dos tipos de cebadores.

1. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico diana comprende una variación nucleotídica.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico diana es una secuencia de ácido nucleico preamplificada.

12. Un procedimiento de detección de una secuencia de ácido nucleico diana de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos usando una reacción de escisión en 5 y una reacción de extensión en 3' de un cebador de hibridación y detección de la diana (cebador HDD), que comprende las etapas de:

(a) hibridar la secuencia de ácido nucleico diana con un par de cebadores compuesto por dos cebadores como cebador directo y cebador inverso en los que al menos un cebador es el cebador HDD capaz de amplificar la secuencia de ácido nucleico diana, en los que el cebador HDD comprende (i) una secuencia nucleotídica de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana y (ii) un marcador o un sistema marcador interactivo que contiene una pluralidad de marcadores;

(b) poner en contacto el resultante de la etapa (a) con una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde que tiene una actividad nucleasa de 5 a 3 en las condiciones de la reacción de escisión en 5 y la reacción de extensión en 3 de los dos cebadores mediante la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde; en el que los dos cebadores se extienden por acción de la actividad polimerasa de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde y es escindido por la actividad nucleasa de 5' a 3' de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde para liberar el marcador, o al menos un marcador del sistema marcador interactivo del cebador HDD entre los dos cebadores, de modo que se obtiene una señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana;

(c) desnaturalizar el resultante de la etapa (b);

(d) repetir las etapas (a)-(c) al menos dos veces para amplificar tanto la secuencia de ácido nucleico diana como la señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana; y

(e) detectar la señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana, en el que la detección se realiza para cada ciclo de la repetición de la etapa (d), al final de la repetición de la etapa (d) o en cada uno de los intervalos de tiempo predeterminados durante la repetición, de forma que la señal es Indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el cebador HDD usado tiene una estructura de oligonucleótido de cebado doble (OCD) representada por la siguiente fórmula general I o una estructura de oligonucleótido de especificidad doble modificado (OEDm) representada por la siguiente fórmula general II:

5'-Xp-Yq-Zr3' (I)

en la que Xp representa una primera porción de cebado en 5 que tiene una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; Yq representa una porción de separación que comprende al menos tres bases universales, Zr representa una segunda porción de cebado en 3' que tiene una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; p, q y r representan el número de nucleótidos, y X, Y y Z son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos; la Tm de la primera porción de cebado en 5 es más alta que la de la segunda porción de cebado en 3' y la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones; la porción de separación separa la primera porción de cebado en 5 de la segunda porción de cebado en 3' en términos de acontecimientos de hibridación al ácido nucleico diana, de modo que la especificidad de la hibridación del oligonucleótido viene determinada doblemente por la primera porción de cebado en 5 y la segunda porción de cebado en 3' de forma que la especificidad de hibridación global del cebador HDD es potenciada;

5'-X'p-Y'q-Z'r3' (||)

en la que X'p representa una primera porción de cebado en 5 que tiene una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; Y'q representa una porción de separación que comprende al menos tres bases universales, Z'r representa una segunda porción de cebado en 3' que tiene una secuencia de

nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; p, q y r representan el número de nucleótidos, y X1, Y1 y Z' son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos; la Tm de la primera porción de cebado en 5 es inferior a la de la segunda porción de cebado en 3' y la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones de X'p, Y'q and Z'r; la porción de separación separa la segunda porción de cebado en 5 de la primera porción de cebado en 3' en términos de acontecimientos de hibridación al ácido nucleico diana, de modo que la especificidad de la hibridación del ollgonucleótldo viene determinada doblemente por la primera porción de cebado en 5 y la segunda porción de cebado en 3' de forma que la especificidad de hibridación global del cebador HDD es potenciada.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el cebador HDD comprende al menos un marcador en su porción terminal en 5.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el cebador HDD comprende al menos un marcador en su extremo 5.

16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el sistema marcador interactivo es un par de una molécula Indicadora fluorescente y una molécula inactivadora colocada en el cebador HDD para inactivar la fluorescencia de la molécula Indicadora y los dos cebadores están separados por un sitio dentro del cebador HDD susceptible a la escisión por nucleasa, de modo que permite que la actividad nucleasa de 5' a 3' de la ácido nucleico pollmerasa dependiente de molde separe la molécula indicadora fluorescente de la molécula inactivadora escindiendo en el sitio susceptible, obteniendo de este modo la señal Indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.

17. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la molécula indicadora fluorescente es localizada en la porción terminal en 5 del cebador HDD y la molécula inactivadora es localizada en 3 de la molécula indicadora fluorescente.

18. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la molécula inactivadora es localizada en la porción terminal en 5 del cebador HDD y la molécula indicadora fluorescente es localizada en 3 de la molécula inactivadora.

19. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la secuencia de ácido nucleico diana comprende al menos dos tipos de secuencias de ácido nucleico y cada uno de los dos cebadores así como el cebador directo y el cebador inverso comprende al menos dos tipos de cebadores.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la secuencia de ácido nucleico diana comprende una variación nucleotídica.

21. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el procedimiento es realizado de acuerdo con una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el par de cebadores en el que al menos un cebador es el cebador HDD.

22. Un kit de detección de una secuencia de ácido nucleico diana de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos usando una reacción de escisión en 5 y una reacción de extensión en 3' de un cebador de hibridación y detección de la diana (cebador HDD), que comprende:

(a) el cebador HDD que comprende (i) una secuencia nucleotídica de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana y (ii) un marcador o un sistema marcador interactivo que contiene una pluralidad de

marcadores; y

(b) una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde que tiene una actividad nucleasa de 5 a 3, en el que cuando el cebador HDD híbrida con la secuencia de ácido nucleico diana, el cebador HDD se extiende mediante la actividad polimerasa de la ácido nucleico polimerasa y el cebador para HDD se escinde mediante actividad de nucleasa 5 a 3 de la ácido nucleico polimerasa para liberar el marcador o al menos un marcador di sistema marcador interactivo del cebador HDD, de modo que se obtiene una señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.

en el que un kit de detección de una secuencia de ácido nucleico diana a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos, que comprende

una sonda dischminativa diana (sonda TD) que tiene una estructura de oligonucleótido de especificidad doble modificado (OEDm) representado por la siguiente fórmula general I para permitir discriminar la secuencia de ácido nucleico diana de una secuencia de ácido nucleico no diana:

S'-X'p-Y'q-Z'r-S'OI)

en la que X'p representa a segunda porción de hibridación en 5 que tiene una secuencia nucleotídica de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; Y'q representa una porción de separación que comprende al menos tres bases universales, Z'r representa una primera porción de hibridación en 3 que tiene una secuencia

nucleotfdica de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; p, q y r representan el número de nucleótidos; yX', Y' y Z' son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos; la Tm de la segunda porción de hibridación en 5 es inferiora la de la primera porción de hibridación en 3 y la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones de in X'p, Y'q y Z'r; la porción de separación separa la segunda porción de hibridación en 5 de la primera porción de hibridación en 3 en términos de acontecimientos de hibridación a la secuencia de ácido nucleico diana, de modo que la especificidad de la hibridación de la sonda TD se determina de forma dual mediante la segunda porción de hibridación en 5 y la primera porción de hibridación en 3 de forma que la especificidad global de la hibridación de la sonda TD se potencia; en la que cuando la sonda TD hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana, tanto la segunda porción de hibridación en 5 como la primera porción de hibridación en 3 hibridan con la secuencia de ácido nucleico diana; en la que cuando la sonda TD hibrida con la secuencia de ácido nucleico no diana, tanto la segunda porción de hibridación en 5 como la porción de separación forman una sola hebra, de modo que la sonda TD permite la discriminación de la secuencia de ácido nucleico diana de la secuencia de ácido nucleico no diana.

23. El kit de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el kit comprende además al menos un cebador adicional, una sonda marcada o su combinación.

24. El kit de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el cebador HDD tiene una estructura de oligonucleótido de cebado doble (OCD) representado por la siguiente fórmula general I:

5'-XP-Yq-Zr3' (I)

en la que Xp representa una primera porción de cebado en 5 que tiene una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; Yq representa una porción de separación que comprende al menos tres bases universales, Zr representa una segunda porción de cebado en 3' que tiene una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; p, q y r representan el número de nucleótidos, y X, Y y Z son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos; la Tm de la primera porción de cebado en 5 es más alta que la de la segunda porción de cebado en 3' y la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones; la porción de separación separa la primera porción de cebado en 5 de la segunda porción de cebado en 3' en términos de acontecimientos de hibridación al ácido nucleico diana, de modo que la especificidad de la hibridación del oligonucleótido viene determinada doblemente por la primera porción de cebado en 5 y la segunda porción de cebado en 3', de forma que la especificidad de hibridación global del cebador es potenciada.