Detección de una secuencia de ácidos nucleicos diana mediante un ensayo de escisión y extensión de PTO.

Método para detectar una secuencia de ácido nucleico diana a partir de un ADN o de una mezcla de ácidos nucleicos mediante un ensayo PTOCE (escisión y extensión de PTO) en una fase líquida,

el cual comprende:

(a) Hibridación de la secuencia de ácido nucleico diana con un oligonucleótido situado corriente arriba y un PTO (oligonucleótido de sondeo y marcaje); en que dicho oligonucleótido situado corriente arriba comprende una secuencia de nucleótidos complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana y se hibrida con ella; el PTO comprende: (I) un segmento localizador en 3' que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana con la cual se hibrida; y (II) un segmento de marcaje en 5' que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana; en el que el segmento localizador en 3' se hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana y el segmento de marcaje en 5' no se hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana; el oligonucleótido situado corriente arriba está ubicado antes del PTO;

(b) Puesta en contacto del resultado de la etapa (a) con una enzima dotada de actividad 5'-nucleasa en las condiciones para la escisión del PTO; en el que el oligonucleótido situado corriente arriba o su hebra extendida induce la escisión del PTO por una enzima dotada de actividad 5'-nucleasa de tal modo que la escisión libera un fragmento que comprende el segmento de marcaje en 5' o una parte del segmento de marcaje en 5' del PTO;

(c) Hibridación del fragmento desprendido del PTO con el CTO (oligonucleótido de captura y molde); en el que el CTO comprende en dirección 3' a 5': (I) un segmento de captura que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con el segmento de marcaje en 5' o una parte de este segmento de marcaje en 5'del PTO, y (II) un segmento molde que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con el segmento de marcaje en 5' ni con el segmento localizador en 3' del PTO; en el que el fragmento desprendido del PTO se hibrida con el segmento de captura del CTO;

(d) Realización de una reacción de extensión con el resultado de la etapa (c) y una polimerasa de ácido nucleico dependiente de molde; en la cual el fragmento hibridado con el segmento de captura del CTO se extiende y forma un ácido nucleico bicatenario extendido; en el que el valor de Tm del ácido nucleico bicatenario extendido puede ajustarse con: (I) la secuencia y/o la longitud del fragmento, (II) la secuencia y/o la longitud del CTO, o (III) la secuencia y/o la longitud del fragmento y la secuencia y/o la longitud del CTO; en que el ácido nucleico bicatenario extendido proporciona una señal diana mediante (I) al menos un marcador unido al fragmento y/o al CTO, (II) un marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión, (III) al menos un marcador unido al fragmento y/o al CTO y un marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión, o (IV) un marcador intercalante;

(e) Detección del ácido nucleico bicatenario extendido mediante la medición de la señal diana en una fase líquida a una temperatura prefijada en la que el ácido nucleico bicatenario extendido mantiene su forma bicatenaria; de modo que la presencia del ácido nucleico bicatenario extendido indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana; en el que el ácido nucleico bicatenario extendido no permanece inmovilizado sobre un sustrato sólido.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E13196447.

Solicitante: SEEGENE, INC..

Nacionalidad solicitante: República de Corea.

Dirección: 8Fl, 9Fl Taewon Bldg. 65-5, Bangi-dong Songpa-gu Seoul 138-050 REPUBLICA DE COREA.

Inventor/es: LEE,YOUNG JO, CHUN,Jong-Yoon.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/11 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
  • C12Q1/48 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una transferasa.
  • C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2628327_T3.pdf

 

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