Detección de una secuencia de ácidos nucleicos diana mediante un ensayo de escisión y extensión de PTO.

Método para detectar una secuencia de ácido nucleico diana a partir de un ADN o de una mezcla de ácidos nucleicos mediante un ensayo PTOCE (escisión y extensión de PTO) en una fase líquida,

el cual comprende:

(a) Hibridación de la secuencia de ácido nucleico diana con un oligonucleótido situado corriente arriba y un PTO (oligonucleótido de sondeo y marcaje); en que dicho oligonucleótido situado corriente arriba comprende una secuencia de nucleótidos complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana y se hibrida con ella; el PTO comprende: (I) un segmento localizador en 3' que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana con la cual se hibrida; y (II) un segmento de marcaje en 5' que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana; en el que el segmento localizador en 3' se hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana y el segmento de marcaje en 5' no se hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana; el oligonucleótido situado corriente arriba está ubicado antes del PTO;

(b) Puesta en contacto del resultado de la etapa (a) con una enzima dotada de actividad 5'-nucleasa en las condiciones para la escisión del PTO; en el que el oligonucleótido situado corriente arriba o su hebra extendida induce la escisión del PTO por una enzima dotada de actividad 5'-nucleasa de tal modo que la escisión libera un fragmento que comprende el segmento de marcaje en 5' o una parte del segmento de marcaje en 5' del PTO;

(c) Hibridación del fragmento desprendido del PTO con el CTO (oligonucleótido de captura y molde); en el que el CTO comprende en dirección 3' a 5': (I) un segmento de captura que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con el segmento de marcaje en 5' o una parte de este segmento de marcaje en 5'del PTO, y (II) un segmento molde que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con el segmento de marcaje en 5' ni con el segmento localizador en 3' del PTO; en el que el fragmento desprendido del PTO se hibrida con el segmento de captura del CTO;

(d) Realización de una reacción de extensión con el resultado de la etapa (c) y una polimerasa de ácido nucleico dependiente de molde; en la cual el fragmento hibridado con el segmento de captura del CTO se extiende y forma un ácido nucleico bicatenario extendido; en el que el valor de Tm del ácido nucleico bicatenario extendido puede ajustarse con: (I) la secuencia y/o la longitud del fragmento, (II) la secuencia y/o la longitud del CTO, o (III) la secuencia y/o la longitud del fragmento y la secuencia y/o la longitud del CTO; en que el ácido nucleico bicatenario extendido proporciona una señal diana mediante (I) al menos un marcador unido al fragmento y/o al CTO, (II) un marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión, (III) al menos un marcador unido al fragmento y/o al CTO y un marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión, o (IV) un marcador intercalante;

(e) Detección del ácido nucleico bicatenario extendido mediante la medición de la señal diana en una fase líquida a una temperatura prefijada en la que el ácido nucleico bicatenario extendido mantiene su forma bicatenaria; de modo que la presencia del ácido nucleico bicatenario extendido indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana; en el que el ácido nucleico bicatenario extendido no permanece inmovilizado sobre un sustrato sólido.