Método para amplificar una secuencia de ADN desconocida adyacente a una secuencia conocida.

Método para amplificar una secuencia de nucleótidos desconocida adyacente a una secuencia de nucleótidosconocida,

que comprende la fase de (a) realizar una amplificación primaria de la secuencia de nucleótidos desconocidautilizando un cebador de control de fijación de desplazamiento de ADN (DW-ACP) y un primer cebador específico objetivo(TSP) hibridizable con un lugar en la secuencia de nucleótidos conocida; en el cual la fase (a) comprende:(a-1) realizar una amplificación de la primera fase de la secuencia de nucleótidos desconocida a una primera temperaturade fijación, comprendiendo al menos un ciclo de fijación de cebador, extensión de cebador y desnaturalización, utilizandoun primer DW-ACP degenerado con una fórmula general I de 5'-Xp-Yq- Zr-Qs-3'; donde, Xp representa una parte delextremo de 5 ' con una secuencia de nucleótidos preseleccionada, Yq representa una parte reguladora que comprendepor lo menos dos residuos análogos de base universal o de base no discriminatoria, Zr representa una secuencia aleatoriadegenerada con una secuencia de nucleótidos aleatoria degenerada, Qs representa una parte del extremo de 3 ' con unasecuencia de nucleótidos hibridizante sustancialmente complementaria a un lugar en dicha secuencia de nucleótidosdesconocida donde hibridizarse, p, q, r y s representan el número de nucleótidos, y X, Y, Z y Q son desoxirribonucleótidoso ribonucleótidos donde dicha parte del extremo de 3' (Qs) tiene una secuencia de nucleótidos arbitraria; cuando laprimera temperatura de fijación permite que el primer DW-ACP degenerado funcione como cebador, por el cual se generaun primer producto de extensión de DW-ACP degenerado; y (a-2), realizar una amplificación de segunda fase delproducto de amplificación generado a partir de la fase (a-1) en una segunda temperatura de fijación que es superior a laprimera temperatura de fijación, que comprende al menos un ciclo de fijación de cebador, extensión de cebador ydesnaturalización utilizando el primer DW-ACP degenerado tal como se utiliza en la fase (a-1) y el primer TSP, bajocondiciones en las cuales cada cebador se fija en su secuencia de nucleótidos objetivo, por las cuales se genera unproducto de amplificación primario.

Método para amplificar una secuencia de ADN desconocida adyacente a una secuencia conocida

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método para amplificar una secuencia de nucleótidos desconocida adyacente a una secuencia de nucleótidos conocida, y en particular a un método para amplificar una secuencia de nucleótidos desconocida utilizando únicamente cebadores diseñados y sus aplicaciones.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) presenta el método más efectivo para amplificar de forma selectiva fragmentos específicos de ADN. En el proceso de PCR, los oligonucleótidos complementarios a las secuencias conocidas de 5’ y 3’ laterales al ácido nucleico objetivo sirven como “cebadores” y juegan un papel determinante.

La aplicación de la PCR para aislar y analizar una región de ADN determinada requiere conocer las secuencias de ADN laterales a la región de interés. Generalmente ello limita la amplificación a regiones de una secuencia de ADN conocida. A falta de la información necesaria sobre la secuencia, la amplificación de la PCR de una fracción de ADN objetivo en una población de ADN compleja, probablemente tendrá como resultado la amplificación de un ADN no objetivo.

Se han desarrollado y modificado muchos métodos basados en la PCR para aislar una secuencia de ADN desconocida lateral a regiones de secuencias conocidas. Entre ellas se incluyen la PCR inversa (Triglia et al, 1988) , la panhandle PCR (Shyamala et al., 1989; Jones and Winistorfer, 1997) , la vectorette PCR (Arnold et al., 1991) , PCR anclada (Roux et al., 1990) , AP-PCR (Dominguez et al., 1994; Trueba and Johnson, 1996) , captura de PCR (Lagerstrom et al., 1991) , y PCR ligada con adaptador o cassette (Iwahana et al., 1994; Riley et al., 1990; Siebert et al., 1995; Willems, 1998; Kilstrup and Kristiansen, 2000) .

Sin embargo, estos métodos presentan limitaciones, como por ejemplo la necesidad de digerir el ADN con enzimas de restricción, ligar el ADN digerido con enlaces o con cassettes de oligonucleótido bicatenario, parcialmente bicatenario o monocatenario, y purificar y / o subclonar los productos antes de la secuencia. La necesidad de realizar múltiples fases en estos protocolos los convierte en engorrosos e ineficaces. Asimismo, el problema común en estos métodos es la gran cantidad de productos secundarios y no específicos debido a las uniones no específicas del vector, el adaptador, la cassette o los cebadores de cola.

Por lo tanto, la metodología fue mejorada todavía más con el fin de proporcionar un sistema de biotina / estreptavidina para capturar fragmentos biotinilados de interés antes de realizar la PCR anidada (Rosenthal and Jones, 1990; Mishra et al. 2002) . Este método presenta una mejora para reducir las interferencias y permitir la amplificación de la región lateral de cualquier secuencia conocida, pero requiere un proceso complicado de fase de inmovilización, a la vez que presenta un coste muy elevado.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Con el fin de liberarse de las limitaciones de las tecnologías convencionales descritas más arriba, el presente inventor ha investigado intensamente con el fin de desarrollar planteamientos capaces de eliminar de forma fundamental y completa los problemas en la amplificación de la secuencia desconocida, y como resultado de ello descubrió un nuevo método para amplificar una secuencia desconocida adyacente a una secuencia conocida, lo cual permite amplificar una secuencia desconocida de una manera mucho más fiable y conveniente.

Por consiguiente, uno de los objetos de esta invención es proporcionar un método para amplificar una secuencia de nucleótidos desconocida adyacente a una secuencia de nucleótidos conocida.

Asimismo, se describe un cebador específico objetivo para amplificar una secuencia de nucleótidos conocida, así como un kit para amplificar una secuencia de nucleótidos desconocida.

Otros objetos y ventajas de la presente invención se pondrán de manifiesto a partir de la descripción detallada a continuación, asumida conjuntamente con las reivindicaciones y dibujos adjuntos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1A muestra una representación esquemática de una realización específica del proceso de amplificación primaria, utilizando un primer cebador de control de fijación de desplazamiento de ADN degenerado (DW-ACP) y un primer cebador específico para el objetivo con una estructura de oligonucleótido de especificidad dual (DSO- TSPl) .

La FIG. 1B representa de forma esquemática una realización específica del proceso de amplificación secundaria utilizando un segundo DW-ACP y un segundo cebador específico para el objetivo con una estructura de oligonucleótido de especificidad dual (DS0-TSP2) .

La FIG. 2 muestra los productos amplificados generados por el desplazamiento de ADN en ACP-DSO PCR para la amplificación de las secuencias de ADN de genoma humano adyacentes a un transgen originado a partir del retrovirus MFG. La columna M muestra la escalera de ADN de 100 bp. Las columnas A, T, G y C representan los resultados de las amplificaciones utilizando DW-ACPl-A5, DW-ACPl-T, DW-ACPl-G y DW-ACPl-C, respectivamente.

La FIG. 3 representa los resultados de la identificación de los lugares de inserción dentro de las secuencias del genoma humano. Los productos de PCR clonados se denominan como DW#.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En un aspecto de esta invención, se proporciona un método para amplificar una secuencia de nucleótidos desconocida adyacente a una secuencia de nucleótidos conocida, según la reivindicación 1 adjunta.

La invención expuesta pertenece a un método exclusivo para amplificar de forma selectiva una secuencia de ADN desconocida adyacente a regiones conocidas de secuencias de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos utilizando un cebador de control de fijación de desplazamiento de ADN (en adelante referido como "DW- ACP") y un nuevo cebador específico de objetivo.

Para contrarrestar los problemas de los métodos de desplazamiento de ADN (o genoma) actuales que incluyen fases múltiples y complicadas, así como a los antecedentes inherentes de los métodos basados en la PCR, el sistema de Cebador de Control de Fijación (ACP) , que ha sido desarrollado por el presente inventor y expuesto en WO 03/050305, se ha modificado para amplificar de forma selectiva una secuencia desconocida adyacente a regiones de secuencias conocidas. Dado que el sistema ACP es capaz de mejorar de forma significativa la especificidad de la amplificación, la utilización de ACP impide fundamentalmente el cebado no específico de un cebador durante la amplificación, a la vez que también simplifica el proceso de amplificación en esta aplicación.

De acuerdo con la presente invención, el primer DW-ACP degenerado tiene una fórmula general I:

5'-Xp-Yq- Zr-Qs-3' (I)

donde, Xp representa una parte del extremo de 5' con una secuencia de nucleótidos preseleccionada, Yq representa una parte reguladora que comprende por lo menos dos residuos análogos de base universal o de base no discriminatoria, Zr representa una parte de secuencia aleatoria degenerada con una secuencia de nucleótidos aleatoria degenerada, Qs representa una parte del extremo de 3' con una secuencia de nucleótidos hibridizante sustancialmente complementaria a un lugar en dicha secuencia de nucleótidos desconocida donde hibridizarse, p, q, r y s representan el número de nucleótidos, y X, Y, Z y Q son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos.

El primer DW-ACP de esta invención ha sido desarrollado para la amplificación de una secuencia de nucleótidos desconocida adyacente a una secuencia de nucleótidos conocida utilizando y modificando los principios de cebadores de control de desplazamiento desarrollados por el presente inventor y expuestos en WO 03/050305.

El principio del primer DW-ACP degenerado se basa en la composición de un cebador de oligonucleótido con diferentes partes extremas de 3' y 5' separadas por una parte reguladora que comprende por lo menos dos residuos análogos de base universal o de base no discriminatoria y el efecto de la parte reguladora sobre las partes extremas de 3' y 5' en el cebador de oligonucleótido. La presencia de la parte reguladora entre las partes del extrema de 3' y 5 ' del primer DW-ACP degenerado actúa como factor principal, que es responsable de la mejora de la especificidad de fijación del cebador.

El término "ácido nucleico" o "nucleótido" es un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido, ya sea en forma monocatenaria o bicatenaria, incluyendo... [Seguir leyendo]

1. Método para amplificar una secuencia de nucleótidos desconocida adyacente a una secuencia de nucleótidos conocida, que comprende la fase de (a) realizar una amplificación primaria de la secuencia de nucleótidos desconocida utilizando un cebador de control de fijación de desplazamiento de ADN (DW-ACP) y un primer cebador específico objetivo (TSP) hibridizable con un lugar en la secuencia de nucleótidos conocida; en el cual la fase (a) comprende:

(a-1) realizar una amplificación de la primera fase de la secuencia de nucleótidos desconocida a una primera temperatura de fijación, comprendiendo al menos un ciclo de fijación de cebador, extensión de cebador y desnaturalización, utilizando un primer DW-ACP degenerado con una fórmula general I d.

5. Xp-Yq- Zr-Qs-3'; donde, Xp representa una parte del extremo de 5 ' con una secuencia de nucleótidos preseleccionada, Yq representa una parte reguladora que comprende por lo menos dos residuos análogos de base universal o de base no discriminatoria, Zr representa una secuencia aleatoria degenerada con una secuencia de nucleótidos aleatoria degenerada, Qs representa una parte del extremo de 3 ' con una secuencia de nucleótidos hibridizante sustancialmente complementaria a un lugar en dicha secuencia de nucleótidos desconocida donde hibridizarse, p, q, r y s representan el número de nucleótidos, y X, Y, Z y Q son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos donde dicha parte del extremo de 3’ (Qs) tiene una secuencia de nucleótidos arbitraria; cuando la primera temperatura de fijación permite que el primer DW-ACP degenerado funcione como cebador, por el cual se genera un primer producto de extensión de DW-ACP degenerado; y (a-2) , realizar una amplificación de segunda fase del producto de amplificación generado a partir de la fase (a-1) en una segunda temperatura de fijación que es superior a la primera temperatura de fijación, que comprende al menos un ciclo de fijación de cebador, extensión de cebador y desnaturalización utilizando el primer DW-ACP degenerado tal como se utiliza en la fase (a-1) y el primer TSP, bajo condiciones en las cuales cada cebador se fija en su secuencia de nucleótidos objetivo, por las cuales se genera un producto de amplificación primario.

2. Método de acuerdo con la reivindicación no. 1, en que dicha amplificación de primera fase se realiza para un ciclo.

3. Método de acuerdo con la reivindicación no. 1, en que la amplificación de segunda fase se realiza para al menos 5 ciclos.

4. Método de acuerdo con la reivindicación no.1, en que dicha primera temperatura de fijación se encuentra entre 35ºC y 50ºC.

5. Método de acuerdo con la reivindicación no.1, en que dicha segunda temperatura de fijación se encuentra entre 50ºC y 72ºC.

6. Método de acuerdo con la reivindicación no. 1, en que el método también comprende la fase (b) de realizar una amplificación secundaria a una tercera temperatura de fijación, que comprende al menos un ciclo de fijación de cebador, extensión de cebador y desnaturalización, utilizando (i) un segundo DW-ACP con una secuencia de nucleótidos para hibridizar con la secuencia de nucleótidos del sentido contrario con la primera secuencia de DW-ACP degenerada presente en el extremo de 3’ del producto de amplificación primario o un cebador con una secuencia de nucleótidos correspondiente a la parte del extremo de 5’ del primer DW-ACP degenerado y (ii) un segundo TSP anidado diseñado para amplificar una región interna del producto de amplificación primaria

7. Método de acuerdo con la reivindicación no. 6, en que el segundo DW-ACP tiene una fórmula general II:

5'-X’p Su-Y'v - Z'w-3' (II)

en que X'p representa una parte del extremo de 5' con una secuencia de nucleótidos correspondiente a la parte del extremo de 5’ del primer DW-ACP degenerado, Su representa una parte de fijación suplementaria que comprende una secuencia de nucleótidos para hibridizar en una parte opuesta a la parte del regulador del primer DW-ACP degenerado en el producto de amplificación degenerado de la fase (a-2) , Y'v representa una parte reguladora que comprende al menos dos residuos análogos de base universal o de base no discriminatoria e impide la fijación de dichas partes X'p y Su en secuencias no objetivo, excepto en la secuencia complementaria al primer DW-ACP degenerado, Z'w representa una parte del extremo de 3’ con una secuencia de nucleótidos correspondiente a la parte del extremo de 3’ del primer DW-ACP degenerado, p, u, v y w representan el número de nucleótidos y X', S, Y', y Z' son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos.

8. Método de acuerdo con la reivindicación no. 7, en que el método también comprende la fase (a’) de purificación de una reacción resultante de la fase (a) para eliminar el primer DW-ACP degenerado, el segundo DW-ACP y el primer cebador específico de objetivo antes de realizar la fase (b) .

9. Método de acuerdo con la reivindicación no. 7, en que el método también comprende la fase (c) de realizar una tercera amplificación a una cuarta temperatura de fijación, que comprende por lo menos un ciclo de fijación de cebador, extensión de fijador y desnaturalización, utilizando (i) el segundo DW-ACP o un cebador con una secuencia de nucleótidos correspondiente a la parte del extremo de 5’ del primer DW-ACP degenerado y (ii) un tercer TSP anidado diseñado para amplificar una región interna del producto de amplificación secundaria.

10. Método de acuerdo con la reivindicación no. 1, en que el primer, segundo y / o tercer TSP tiene una fórmula general

III:

5'-X"p-Y"q-Z"r-3' (III)

en que X"p representa una parte de 5’ de alta especificidad de Tm con una secuencia de nucleótidos hibridizante sustancialmente complementaria a un lugar en la secuencia de nucleótidos conocida para hibridizarse, Y’’q representa una parte de separación que comprende por los menos dos bases universales, Z’’ representa una parte de 3’ de baja especificidad de Tm con una secuencia de nucleótidos hibridizante sustancialmente complementaria a un lugar en la secuencia de nucleótidos conocida para hibridizarse, p, q y r representan el número de nucleótidos, p es un número entero del 15 al 40, q es un número entero del 3 al 10, r es un número entero del 3 al 15 y X’’, Y’’ y Z’’ son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos; la temperatura de la parte de 5’ de alta especificidad de Tm es superior a la de la parte de 3’ de baja especificidad de Tm, la parte de separación tiene la Tm más baja de las tres partes; la Tm de la parte de alta especificidad de Tm de 5’ está entre 40ºC y 80ºC, la Tm de la parte de baja especificidad de Tm de 3’ está entre 10ºC y 40ºC y la Tm de la parte de separación está entre 3ºC y 15ºC; la parte de separación forma una estructura de burbuja de base de no paridad bajo condiciones en las que la parte de 5’ de alta especificidad de Tm y la parte de 3’ de baja especificidad de Tm son fijadas al ácido nucleico de muestra, permitiendo que la parte de alta especificidad de Tm de 5’se separe de la parte de baja especificidad de Tm de 3’ en términos de especificidad de fijación a un ácido nucleico de muestra, por lo cual la especificidad de fijación del cebador se determina de forma dual por la parte de 5’ de alta especificidad de Tm y la parte de 3’ de baja especificidad de Tm de manera que la especificidad de fijación global del cebador experimenta una mejora.

11. Método de acuerdo con la reivindicación no. 1, en que el residuo análogo de la base universal o de la base no discriminatoria se selecciona a partir del grupo que consta de deoxinosina, inosina, 7-deaza-2' -deoxiinosina, 2-aza-2'deoxiinosina.

2. OMe inosina.

2. F inosina, deoxi 3-nitropirrol, 3-nitropirrol.

2. 0Me 3-nitropirrol.

2. F 3-nitropirrol, l- (2'-deoxibeta-D- ribofuranosil) -3-nitropirrol, deoxi 5-nitroindol, 5-nitroindol.

2. 0Me 5-nitroindol.

2. F 5- nitroindol, deoxi 4nitrobenzimidazol, 4-nitrobenzimidazol, deoxi 4-aminobenzimidazol, 4-aminobenzimidazol, deoxi nebularina.

2. F nebularina.

2. F 4-nitrobenzimidazol, PNA-5- introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, PNA-4-nitrobenzimidazol, PNA-3nitropirrol, morfolino-5-nitroindol, morfolino-nebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitrobenzimidazol, morfolino-3nitropirrol, fosforamidato-5-nitroindol, fosforamidato-nebularina, fosforamidato-inosina, fosforamidato-4- nitrobenzimidazol, fosforamidato-3-nitropirrol.

2. 0-metoxietil inosina, 2'O- metoxietil nebularina.

2. 0-metoxietil 5-nitroindol.

2. 0-metoxietil 4nitrobenzimidazol.

2. 0-metoxietil 3-nitropirrol, y combinaciones de los mismos.

12. Método de acuerdo con la reivindicación no. 12, en que el residuo análogo de base universal o de base no discriminatoria es deoxinosina, inosina, l- (2'-deoxi-beta-D-ribofuranosil) -3-nitropirrol o 5- nitroindol.

13. Método de acuerdo con la reivindicación no. 1, en que la parte reguladora y la parte de separación comprenden nucleótidos contiguas con residuos análogos de bases universales o de bases no discriminatorias.

14. Método de acuerdo con la reivindicación no. 1, en que p representa un número entero entre 10 y 60.

15. Método de acuerdo con las reivindicaciones no. 1 o 7, en que q o u es por lo menos 3.

16. Método de acuerdo con las reivindicaciones no. 1 o 7, en que q o u representa un número entero entre 3 y 10.

17. Método de acuerdo con las reivindicaciones no. 1 o 7, en que r o v representa un número entero entre 2 y 5.

18. Método de acuerdo con las reivindicaciones no. 1 o 7, en que s o w representa un número entero entre 3 y 10.

19. Método de acuerdo con la reivindicación no. 7, en que S comprende por lo menos 2 nucleótidos de deoxiguanosina contiguas.

20. Método de acuerdo con la reivindicación no. 10, en que la parte de alta especificidad de Tm de 5’ es más larga que la parte de baja especificidad de Tm de 3’.

21. Método de acuerdo con la reivindicación no. 10, en que la parte de baja especificidad de Tm de 3’ tiene la secuencia de nucleótidos hibridizante perfectamente complementaria con el lugar en la secuencia de nucleótidos conocida para hibridizarse.

22. Método de acuerdo con la reivindicación no. 10, en que la parte de alta especificidad de Tm de 5’ tiene una longitud de entre 15 y 25 nucleótidos.

Fig. 2

M. Escalera de ADN 100 bp

A. DW-ACP-A

T. DW-ACP-T

G. DW-ACP-G

C. DW-ACP-C

Fig. 3

Identificación de lugares de inserción de MFG por búsqueda BLAT en humanos

Clon Cromosoma HEBRA Inicio Final (Lugar de inserción)

DW1 1 + 9843694 9844037

DW2 13 + 40059031 40059568

DW3 16 + 68156026 68156201

DW4 2 + 25429017 25429108

DW5 2 + 25429022 25429108

DW6 21 - 41407558 41408014

DW7 19 - 12884434 12884823

DW8 7 - 68695357 68696030

DW9 16 - 73665022 73665507

DW10 7 + 867386 867600

DW11 4 - 90007703 90008006

DW12 16 - 30455287 30455486