Detección de las secuencias de áidos nucleico diana mediante un ensayo de escisión y extensión de PTO.

Método para detectar una secuencia de ácidos nucleicos diana en un ADN o en una mezcla de ácidos nucleicos mediante un ensayo PTOCE (escisión y extensión de PTO),

el cual comprende:

(a) Hibridación de la secuencia de ácidos nucleicos diana con un oligonucleótido situado corriente arriba (upstream) y un PTO (Oligonucleótido de sondeo y marcaje); en el que dicho oligonucleótido situado corriente arriba comprende una secuencia de nucleótidos complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana con la cual se hibrida; el PTO comprende: (I) un segmento localizador en 3' que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana con la cual se hibrida; y (II) un segmento de marcaje en 5' que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana; en el que dicho segmento localizador en 3' se hibrida con la secuencia de ácidos nucleicos diana y el segmento de marcaje en 5' no se hibrida con dicha secuencia de ácidos nucleicos diana; el oligonucleótido situado corriente arriba está ubicado antes del PTO;

(b) Puesta en contacto del resultado de la etapa (a) con una enzima dotada de actividad 5'-nucleasa en condiciones para la escisión del PTO; el oligonucleótido situado corriente arriba o su hebra extendida induce la escisión del PTO por la enzima dotada de actividad 5'-nucleasa de tal modo que la escisión libera un fragmento que comprende el segmento de marcaje en 5' o una parte del segmento de marcaje en 5' del PTO;

(c) Hibridación del fragmento desprendido del PTO con un CTO (Oligonucleótido de captura y molde); el CTO comprende en dirección 3' a 5': (I) un segmento de captura que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con el segmento de marcaje en 5' o una parte de este segmento del PTO, y (II) un segmento molde que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con el segmento de marcaje en 5' ni con el segmento localizador en 3'; de forma que el fragmento desprendido del PTO se hibrida con el segmento de captura del CTO;

(d) Realización de una reacción de extensión con el resultante de la etapa (c) y una polimerasa de ácidos nucleicos dependiente de molde; en ella el fragmento hibridado con el segmento de captura del CTO se extiende y se forma un ácido nucleico bicatenario extendido; este ácido nucleico bicatenario extendido tiene un valor de Tm que puede ajustarse con (I) la secuencia y/o la longitud del fragmento, (II) la secuencia y/o la longitud del CTO o (III) la secuencia y/o la longitud del fragmento y la secuencia y/o la longitud del CTO;

(e) Fusión del ácido nucleico bicatenario extendido a lo largo de un intervalo de temperaturas que da una señal diana indicadora de la presencia del ácido nucleico bicatenario extendido; en ella la señal diana es provista por: (I) al menos un marcador unido al fragmento y/o al CTO, (II) un marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión, (III) un marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión y un marcador unido al fragmento y/o al CTO, o (IV) un marcador intercalante; y

Detección de las secuencias de áidos nucleico diana mediante un ensayo de escisión y extensión de PTO

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la detección de una secuencia de ácidos nucleicos diana mediante un ensayo PTOCE (escisión y extensión de PTO).

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA

La hibridación del ADN es un proceso fundamental en la biología molecular, en el que influyen la fuerza iónica, la composición de bases, la longitud del fragmento a que ha sido reducido el ácido nucleico, el grado de desapareamiento de las bases y la presencia de agentes desnaturalizantes. Las técnicas de hibridación del ADN constituyen herramientas sumamente útiles para la determinación de secuencias de ácidos nucleicos específicas y son sin duda valiosas en disciplinas como el diagnóstico clínico, la investigación genética y el análisis de laboratorio forense.

Con todo, los métodos y procesos convencionales que dependen primordialmente de la hibridación están sujetos a un alto riesgo de resultados positivos falsos a causa de la hibridación inespecífica entre las sondas y las secuencias que no son la diana. Por tanto, existen problemas que de resolverse mejorarían su fiabilidad.

Aparte de los procesos de hibridación con sondas, se han planteado diversas estrategias con reacciones enzimáticas adicionales, como por ejemplo, el método con sonda TaqMan.

En dicho método, la sonda marcada e hibridada con una secuencia de ácidos nucleicos diana es escindida por la actividad 5'-nucleasa de una ADN-polimerasa dependiente de cebador situada corriente arriba (upstream), lo cual genera una señal que indica la presencia de una secuencia diana (Patentes de EE. UU. n.° 5.21.15, 5.538.848 y 6.326.145). El método de la sonda TaqMan sugiere dos estrategias para la generación de la señal: La escisión dependiente de la polimerización y la escisión independiente de la polimerización. En la primera de ellas, la extensión del cebador situado corriente arriba tiene que producirse antes de que la polimerasa de ácidos nucleicos alcance el extremo 5' de la sonda marcada. A medida que la reacción de extensión prosigue, la polimerasa escinde progresivamente el extremo 5'de la sonda marcada. En la segunda modalidad de escisión, el cebador situado corriente arriba y la sonda marcada se hibridan con una secuencia de ácidos nucleicos diana muy próxima, de tal modo que la unión de la polimerasa de ácidos nucleicos al extremo 3 del citado cebador la pone en contacto con el extremo 5'de la sonda marcada para liberar el marcador. Asimismo, el método de la sonda TaqMan expone que la sonda marcada que en su extremo 5' tiene una región de cola 5' no hibridable con la secuencia diana también es escindida y forma un fragmento que comprende la citada región de cola 5'.

Se han descrito otros métodos en que una sonda portadora de una región de cola en 5' no complementaria con la secuencia diana es escindida por una 5'-nucleasa que libera un fragmento que comprende la citada región de cola en 5'.

Por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 5.691.142 da a conocer una estructura de escisión que ha de ser digerida por la actividad 5'-nucleasa de la ADN-polimerasa. A modo de ejemplo se expone una estructura de escisión en la que un oligonucleótido que comprende un segmento 5' que no es complementario y un segmento 3' que es complementario con un molde se hibrida con dicho molde y un oligonucleótido situado corriente arriba se hibrida con el molde muy cerca. La estructura de escisión es desprendida por una ADN-polimerasa dotada de actividad 5'-nucleasa o por una ADN- polimerasa modificada con actividad sintética reducida que libera el segmento 5' que no es complementario con el molde. A continuación, el segmento 5' liberado se hibrida con un oligonucleótido dotado de una horquilla formando una estructura de escisión, provocando así reacciones de escisión progresivas que permiten detectar una secuencia diana.

La patente de EE. UU. N.° 7.381.532 da a conocer un proceso en que la estructura de escisión dotada del oligonucleótido situado corriente arriba con el extremo 3' bloqueado es escindida por una ADN-polimerasa dotada de actividad 5'-nucleasa o por una nucleasa FEN que libera una región «solapa» (flap) 5' no complementaria; esta región solapa 5' liberada es detectada por análisis de tamaño o con un marcador interactivo doble. La patente de EE. UU. N.° 6.893.819 da a conocer que las solapas (flaps) liberadas detectables son producidas con un método de amplificación secuencial mediado por solapa y dependiente de la síntesis de ácidos nucleicos. En este método, una solapa desprendida de una primera estructura de escisión escinde, de un modo dependiente de la síntesis de ácidos nucleicos, una segunda estructura de escisión que a su vez libera una solapa, detectándose las solapas liberadas.

Con la hibridación de sondas marcadas con fluorescencia en una fase líquida es posible detectar simultáneamente una pluralidad de secuencias nucleotídicas diana usando incluso un solo tipo de marcador fluorescente mediante el análisis de la curva de fusión. No obstante, las técnicas convencionales que detectan las secuencias diana mediante la escisión por 5'-nucleasa de sondas con doble mareaje interactivo requieren diversos tipos de marcadores fluorescentes para diferentes secuencias diana si se pretenden detectar simultáneamente múltiples dianas (detección multiplexada), lo cual limita el número de secuencias diana detectables a causa de la limitación en el tipo de marcadores fluorescentes.

La solicitud de patente de EE. UU. 28-241838 da a conocer un método de detección de dianas consistente en la escisión de una sonda dotada de un segmento en 5' no complementario con la secuencia de ácidos nucleicos diana y la hibridación con una sonda de captura. En el segmento 5' no complementario se coloca un marcador. La sonda marcada hibridada con la secuencia diana se escinde y libera un fragmento, y a continuación ese fragmento se hibrida con la sonda de captura que permite detectar la presencia de la secuencia diana. En este método, es necesario que la sonda sin escindir/intacta no se hibride con la sonda de captura. Para ello, es preciso inmovilizar en un sustrato sólido la sonda de captura más corta. No obstante, esa limitación reduce la eficiencia de la hibridación en el sustrato sólido y dificulta la optimización de las condiciones de reacción.

El método de detección de secuencias nucleotídicas para la identificación de polimorfismos o la detección cuantitativa del ADN fue probado por Lyamichev et al.

(Nature Biotechnology, Vol 17 March 1999). Lyamichev y colaboradores usaron endonucleasas flap de arqueobacterias en un protocolo optimizado que comprende la hibridación de una sonda señal y de una sonda invasiva con un nucleótido diana. Después de la escisión, las solapas 5 prima son extendidas con nucleótidos marcados con digoxigenina.

Una revisión de Michael Oliver (Mutation research, 573 (25) 13-11) comenta varias técnicas relativas a métodos de detección con endonucleasas de solapa (flap), entre ellos protocolos para la detección de la solapa 5-prima escindida con espectrometría de masas MALDI-TOF.

Roux P. y colaboradores (Assay and Drug Development Technologies, Vol. 2, No. 6, 24) sugieren el uso de moléculas marcadoras electroforéticas (eTags, en inglés) para la detección de la solapa 5-prima escindida. El ensayo con eTag permite la detección y la cuantificación directa del ARNm prescindiendo de la extracción y la purificación del ARN.

La importancia de las horquillas presentes en la sonda o en los oligonucleótidos invasivos utilizados en el ensayo Invader® es analizada por Allawi y colaboradores (RNA, 214, 1:1153-1161). En dicha referencia se demuestra que la señal de detección generada en el ensayo Invader® depende de la temperatura.

A la vista de lo anterior, resulta patente que desde hace tiempo la disciplina precisa de nuevos enfoques novedosos para la detección de secuencias diana, preferiblemente de varias secuencias a la vez, en una fase líquida o en una fase sólida y no solo basados en la hibridación sino en reacciones enzimáticas como la reacción de escisión nucleolítica en 5' con más facilidad, fiabilidad y reproducibilidad. Asimismo, la técnica también precisa nuevos métodos de detección de dianas que no se vean limitados por la cantidad de tipos de marcadores (en especial de marcadores fluorescentes).

A lo largo de la presente solicitud se ofrecen las referencias de varias patentes y publicaciones y se facilitan las citas bibliográficas entre paréntesis.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Los presentes inventores han llevado... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar una secuencia de ácidos nucleicos diana en un ADN o en una mezcla de ácidos nucleicos mediante un ensayo PTOCE (escisión y extensión de PTO), el cual comprende:

(a) Hibridación de la secuencia de ácidos nucleicos diana con un oligonucleótido situado corriente arriba (upstream) y un PTO (Oligonucleótido de sondeo y marcaje); en el que dicho oligonucleótido situado corriente arriba comprende una secuencia de nucleótidos complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana con la cual se hibrida; el PTO comprende: (I) un segmento localizador en 3' que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana con la cual se hibrida; y (II) un segmento de marcaje en 5' que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana; en el que dicho segmento localizador en 3' se hibrida con la secuencia de ácidos nucleicos diana y el segmento de marcaje en 5' no se hibrida con dicha secuencia de ácidos nucleicos diana; el oligonucleótido situado corriente arriba está ubicado antes del PTO;

(b) Puesta en contacto del resultado de la etapa (a) con una enzima dotada de actividad 5'-nucleasa en condiciones para la escisión del PTO; el oligonucleótido situado corriente arriba o su hebra extendida induce la escisión del PTO por la enzima dotada de actividad 5'-nucleasa de tal modo que la escisión libera un fragmento que comprende el segmento de marcaje en 5' o una parte del segmento de marcaje en 5' del PTO;

(c) Hibridación del fragmento desprendido del PTO con un CTO (Oligonucleótido de captura y molde); el CTO comprende en dirección 3' a 5': (I) un segmento de captura que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con el segmento de marcaje en 5' o una parte de este segmento del PTO, y (II) un segmento molde que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con el segmento de marcaje en 5' ni con el segmento localizador en 3'; de forma que el fragmento desprendido del PTO se hibrida con el segmento de captura del CTO;

(d) Realización de una reacción de extensión con el resultante de la etapa (c) y una polimerasa de ácidos nucleicos dependiente de molde; en ella el fragmento hibridado con el segmento de captura del CTO se extiende y se forma un ácido nucleico bicatenario extendido; este ácido nucleico bicatenario extendido tiene un valor de Tm que puede ajustarse con (I) la secuencia y/o la longitud del fragmento, (II) la secuencia y/o la longitud del CTO o (III) la secuencia y/o la longitud del fragmento y la secuencia y/o la longitud del CTO;

(e) Fusión del ácido nucleico bicatenario extendido a lo largo de un intervalo de temperaturas que da una señal diana indicadora de la presencia del ácido nucleico bicatenario extendido; en ella la señal diana es provista por: (I) al menos un marcador unido al fragmento y/o al CTO, (II) un marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión, (III) un marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión y un marcador unido al fragmento y/o al CTO, o (IV) un marcador intercalante; y

(f) Detección del ácido nucleico bicatenario extendido mediante la medición de la señal diana; de forma que la presencia del ácido nucleico bicatenario extendido indica la presencia de la secuencia de ácidos nucleicos diana.

2. Método acorde con la reivindicación 1, en el que la presencia del ácido nucleico bicatenario extendido se detecta mediante análisis de la fusión.

3. Método acorde con la reivindicación 1, en el que a la fusión de la etapa (e) le sigue la hibridación que proporciona la señal diana indicadora de la presencia del ácido nucleico bicatenario extendido.

4. Método acorde con la reivindicación 3, en el que la presencia del ácido nucleico bicatenario extendido se detecta mediante análisis de la hibridación.

5. Método acorde con la reivindicación 1, en el que la señal diana la proporciona como mínimo un marcador unido al fragmento y/o al CTO.

6. Método acorde con la reivindicación 5, en el que el fragmento o el CTO poseen un marcaje interactivo doble que comprende una molécula indicadora (repórter) y una molécula amortiguadora (quencher); de forma que la fusión del ácido nucleico bicatenario extendido en la etapa (e) induce un cambio de la señal del marcador interactivo doble que da lugar a la señal diana en la etapa (e).

7. Método acorde con la reivindicación 5, en el que el fragmento posee uno de los componentes del marcaje interactivo doble que comprende una molécula indicadora y una molécula amortiguadora y el CTO tiene el otro componente del marcaje interactivo doble; de forma que la fusión del ácido nucleico bicatenario extendido en la etapa (e) induce un cambio de la señal de los dos marcadores interactivos que da lugar a la señal diana en la etapa (e).

8. Método acorde con la reivindicación 5, en el que el fragmento o el CTO tienen un solo marcador, y la fusión del ácido nucleico bicatenario extendido en la etapa (e) induce el cambio de señal del marcador sencillo que da lugar a la señal diana en la etapa (e).

9. Método acorde con la reivindicación 5, en el que los marcadores se pueden ubicar en cualquier punto siempre que cuando se forme un híbrido entre el PTO sin escindir y el CTO, este híbrido no ofrezca una señal no diana en el paso (e).

1. Método acorde con la reivindicación 5, en el que los marcadores están ubicados en cualquier punto siempre que cuando se forme un híbrido entre el PTO sin escindir y el CTO, este híbrido emita una señal que no sea la diana en la etapa (e); en ese caso el valor de Tm del ácido nucleico bicatenario extendido es superior al del híbrido entre el PTO sin escindir y el CTO.

11. Método acorde con la reivindicación 1, en el que la señal diana la proporciona un marcador sencillo incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión; en el que el marcador sencillo incorporado está unido a un nucleótido que se incorpora durante la reacción de extensión; en el que la fusión del ácido nucleico bicatenario extendido en la etapa (e) induce un cambio de la señal emitida por el marcador sencillo que da lugar a la señal diana en la etapa (e).

12. Método acorde con la reivindicación 11, en el que el nucleótido incorporado durante la reacción de extensión tiene una primera base no natural y el CTO tiene un

nucleótido dotado de una segunda base no natural con una afinidad de unión específica hacia la primera base no natural.

13. Método acorde con la reivindicación 1, en el que la señal diana es proporcionada por un marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión y por un marcador unido al fragmento y/o al CTO, y el marcador incorporado está unido a un nucleótido incorporado durante la reacción de extensión; en el que los dos marcadores forman una marcador interactivo doble con una molécula indicadora y una molécula amortiguadora; de forma que la fusión del ácido nucleico bicatenario extendido en la etapa (e) induce el cambio de una señal emitida por el marcador interactivo doble que da lugar a la señal diana en la etapa (e).

14. Método acorde con la reivindicación 13, en el que el nucleótido incorporado durante la reacción de extensión tiene una primera base no natural y el CTO tiene un nucleótido dotado de una segunda base no natural con una afinidad de unión específica hacia la primera base no natural.

15. Método acorde con la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido situado corriente arriba es un cebador situado corriente arriba o una sonda en retroposición.

16. Método acorde con la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido situado corriente arriba tiene una secuencia que se solapa parcialmente con el segmento localizador en 3' del PTO.

17. Método acorde con la reivindicación 1, en el que el segmento de captura comprende en su parte del extremo 5' una secuencia nucleotídica complementaria con la parte del extremo 5' del segmento localizador en 3' del PTO.

18. Método acorde con la reivindicación 1, en el que el método además comprende la repetición de las etapas (a)-(b), (a)-(d) o (a)-(f) con desnaturalización entre los ciclos repetidos.

19. Método acorde con la reivindicación 1, en el que el método se realiza para detectar como mínimo dos tipos de secuencias de ácidos nucleicos diana; en que el oligonucleótido situado corriente arriba comprende al menos dos tipos de oligonucleótidos, el PTO comprende al menos dos tipos de PTO y el CTO comprende al menos un tipo de CTO.

2. Método acorde con la reivindicación 19, en el que los ácidos nucleicos bicatenarios extendidos corresponden como mínimo a dos tipos de las secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen valores de Tm distintos.

21. Método acorde con la reivindicación 1, en el que la enzima dotada de actividad 5'- nucleasa es una ADN-polimerasa termoestable dotada de actividad 5'-nucleasa o una nucleasa FEN.

22. Método acorde con la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácidos nucleicos diana comprende una variación nucleotídica.

23. Método acorde con la reivindicación 1, en el que el CTO permanece inmovilizado por su extremo 5' o su extremo 3' en un sustrato sólido.

24. Método acorde con la reivindicación 23, en el que la señal diana es provista por un solo marcador unido al fragmento o por un solo marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión.

25. Método acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que el método se lleva a cabo en presencia de un cebador situado corriente abajo (downstream).

26. Método acorde con la reivindicación 25, en el que el oligonucleótido situado corriente arriba es un cebador situado corriente arriba, el cebador situado corriente abajo comprende una secuencia nucleotídica complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana con la cual se híbrida, el PTO está localizado entre el cebador situado corriente arriba y el cebador situado corriente abajo, el PTO está bloqueado en su extremo 3' para impedir su extensión y la enzima dotada de actividad 5'-nucleasa es una polimerasa de ácidos nucleicos dependiente de molde.

27. Método acorde con la reivindicación 26, en el que el método además comprende la repetición de las etapas (a)-(b), (a)-(d) o (a)-(f) con desnaturalización entre los ciclos repetidos.

28. Uso de un equipo para detectar una secuencia de ácidos nucleicos diana en un ADN o en una mezcla de ácidos nucleicos mediante un ensayo PTOCE (Escisión y extensión de PTO) para su uso en la realización del método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, el cual comprende:

(a) Un oligonucleótido situado corriente arriba que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana con la cual se híbrida;

(b) Un PTO (Oligonucleótido de sondeo y mareaje) que comprende: (I) un segmento localizador en 3' que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana con la cual se híbrida; y (II) un segmento de mareaje en 5' que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana, en que dicho segmento localizador en 3' se híbrida con la secuencia de ácidos nucleicos diana y el segmento de mareaje en 5' no se híbrida con dicha secuencia de ácidos nucleicos diana; el oligonucleótido situado corriente arriba está situado antes del PTO; el oligonucleótido situado corriente arriba o su hebra extendida induce la escisión del PTO por una enzima dotada de actividad 5'-nucleasa de tal modo que la escisión libera un fragmento que comprende el segmento de mareaje en 5' o una parte del segmento de mareaje en 5' del PTO; y

(c) Un CTO (Oligonucleótido de captura y molde) que comprende en dirección 3' a 5': (I) un segmento de captura que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con el segmento de mareaje en 5' o una parte de este segmento de mareaje en 5' del PTO; y (II) un segmento molde que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con el segmento de mareaje en 5' y el segmento localizador en 3' del PTO; en que el fragmento desprendido del PTO se híbrida con el segmento de captura del CTO; y el fragmento hibridado con el segmento de captura del CTO es extendido por una polimerasa de ácidos nucleicos dependiente de molde hasta formar un ácido nucleico bicatenario extendido.

29. Uso de un equipo acorde con la reivindicación 28, equipo que además comprende una enzima dotada de actividad 5'-nucleasa.

3. Uso de un equipo acorde con la reivindicación 28, en el que el PTO y/o el CTO tienen como mínimo un marcador.

31. Uso de un equipo acorde con la reivindicación 28, equipo que además comprende un marcador que se ha de incorporar al ácido nucleico bicatenario extendido durante la

reacción de extensión.

32. Uso de un equipo acorde con la reivindicación 28, equipo que además comprende un marcador que ha de incorporarse al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión y el PTO y/o el CTO tienen como mínimo un marcador.

33. Uso de un equipo acorde con la reivindicación 28, equipo que además comprende 1 un marcador intercalante.

34. Uso de un equipo acorde con la reivindicación 28, en el que el CTO permanece inmovilizado por su extremo 5' o por su extremo 3' en un sustrato sólido.

35. Uso de un equipo acorde con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 34, en que el equipo además comprende un oligonucleótido situado corriente abajo.

36. El método acorde con la reivindicación 1, en el que las etapas (a)-(f) se llevan a

cabo en un recipiente de reacción o en recipientes de reacción separados.