Detección de secuencias de ácidos nucleicos diana mediante un ensayo de escisión y extensión de PTO.

Un procedimiento de detección de una secuencia de ácido nucleico diana a partir de un ADN o de una mezcla de ácidos nucleicos mediante un ensayo PTOCE (escisión y extensión de PTO) sobre una fase sólida,

que comprende:

(a) Hibridación de la secuencia de ácido nucleico diana con un oligonucleótido situado cadena arriba y un PTO (oligonucleótido de sondeo y marcaje); en el que el oligonucleótido situado cadena arriba comprende una secuencia nucleotídica de hibridación complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana; el PTO comprende: (i) una porción elegida como diana en 3' que comprende una secuencia nucleotídica de hibridación complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana; y (ii) una porción de marcaje en 5' que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana; en el que la porción elegida como diana en 3' se hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana y la porción de marcaje en 5' no se hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana; el oligonucleótido situado cadena arriba está ubicado cadena arriba del PTO;

(b) Poner en contacto el resultado de la etapa (a) con una enzima dotada de actividad 5'-nucleasa en las condiciones para la escisión del PTO; en el que el oligonucleótido situado cadena arriba o su hebra extendida induce la escisión del PTO por la enzima dotada de actividad 5'-nucleasa de tal modo que la escisión desprende un fragmento que comprende la porción de marcaje en 5' o una parte de la porción de marcaje en 5' del PTO;

(c) Hibridación del fragmento desprendido del PTO con un CTO (oligonucleótido de captura y plantilla); en el que el CTO permanece inmovilizado por su extremo 5' o por su extremo 3' en un sustrato sólido; en el que el CTO comprende en dirección 3' a 5': (i) una porción de captura que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con la porción de marcaje en 5' o una parte de la porción de marcaje en 5'del PTO, y (ii) una porción de plantilla que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con la porción de marcaje en 5' ni con la porción elegida como diana en 3' del PTO; en el que el fragmento desprendido del PTO se hibrida con la porción de captura del CTO;

(d) Realización de una reacción de extensión usando el resultado de la etapa (c) y una polimerasa de ácido nucleico dependiente de plantilla; en la cual el fragmento hibridado con la porción de captura del CTO se extiende y forma dúplex extendido; en el que el dúplex extendido tiene un valor de Tm que puede ajustarse mediante (i) una secuencia y/o longitud del fragmento, (ii) una secuencia y/o longitud del CTO, o (iii) la secuencia y/o longitud del fragmento y la secuencia y/o longitud del CTO; en el que el dúplex extendido proporciona una señal diana mediante (i) al menos un marcador unido al fragmento y/o al CTO, (ii) un marcador incorporado al dúplex extendido durante la reacción de extensión, (iii) al menos un marcador unido al fragmento y/o al CTO y un marcador incorporado al dúplex extendido durante la reacción de extensión, o (iv) un marcador intercalante; y

(e) Detección del dúplex extendido mediante la medición de la señal diana sobre el sustrato sólido a una temperatura predeterminada en la que el dúplex extendido mantiene su forma bicatenaria; de modo que la presencia del dúplex extendido indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana; en el que el dúplex extendido permanece inmovilizado sobre el sustrato sólido a través del CTO.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E14186326.

Solicitante: SEEGENE, INC..

Nacionalidad solicitante: República de Corea.

Dirección: 8FL, 9FL Taewon Bldg., 91, Ogeum-ro, Songpa-gu Seoul 05548 REPUBLICA DE COREA.

Inventor/es: LEE,YOUNG JO, CHUN,Jong-Yoon.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/11 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
  • C12Q1/48 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una transferasa.
  • C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2629759_T3.pdf

 

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