Detección de secuencias de ácidos nucleicos diana mediante un ensayo de escisión y extensión de PTO.

Un procedimiento de detección de una secuencia de ácido nucleico diana a partir de un ADN o de una mezcla de ácidos nucleicos mediante un ensayo PTOCE (escisión y extensión de PTO) sobre una fase sólida,

que comprende:

(a) Hibridación de la secuencia de ácido nucleico diana con un oligonucleótido situado cadena arriba y un PTO (oligonucleótido de sondeo y marcaje); en el que el oligonucleótido situado cadena arriba comprende una secuencia nucleotídica de hibridación complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana; el PTO comprende: (i) una porción elegida como diana en 3' que comprende una secuencia nucleotídica de hibridación complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana; y (ii) una porción de marcaje en 5' que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana; en el que la porción elegida como diana en 3' se hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana y la porción de marcaje en 5' no se hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana; el oligonucleótido situado cadena arriba está ubicado cadena arriba del PTO;

(b) Poner en contacto el resultado de la etapa (a) con una enzima dotada de actividad 5'-nucleasa en las condiciones para la escisión del PTO; en el que el oligonucleótido situado cadena arriba o su hebra extendida induce la escisión del PTO por la enzima dotada de actividad 5'-nucleasa de tal modo que la escisión desprende un fragmento que comprende la porción de marcaje en 5' o una parte de la porción de marcaje en 5' del PTO;

(c) Hibridación del fragmento desprendido del PTO con un CTO (oligonucleótido de captura y plantilla); en el que el CTO permanece inmovilizado por su extremo 5' o por su extremo 3' en un sustrato sólido; en el que el CTO comprende en dirección 3' a 5': (i) una porción de captura que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con la porción de marcaje en 5' o una parte de la porción de marcaje en 5'del PTO, y (ii) una porción de plantilla que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con la porción de marcaje en 5' ni con la porción elegida como diana en 3' del PTO; en el que el fragmento desprendido del PTO se hibrida con la porción de captura del CTO;

(d) Realización de una reacción de extensión usando el resultado de la etapa (c) y una polimerasa de ácido nucleico dependiente de plantilla; en la cual el fragmento hibridado con la porción de captura del CTO se extiende y forma dúplex extendido; en el que el dúplex extendido tiene un valor de Tm que puede ajustarse mediante (i) una secuencia y/o longitud del fragmento, (ii) una secuencia y/o longitud del CTO, o (iii) la secuencia y/o longitud del fragmento y la secuencia y/o longitud del CTO; en el que el dúplex extendido proporciona una señal diana mediante (i) al menos un marcador unido al fragmento y/o al CTO, (ii) un marcador incorporado al dúplex extendido durante la reacción de extensión, (iii) al menos un marcador unido al fragmento y/o al CTO y un marcador incorporado al dúplex extendido durante la reacción de extensión, o (iv) un marcador intercalante; y

(e) Detección del dúplex extendido mediante la medición de la señal diana sobre el sustrato sólido a una temperatura predeterminada en la que el dúplex extendido mantiene su forma bicatenaria; de modo que la presencia del dúplex extendido indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana; en el que el dúplex extendido permanece inmovilizado sobre el sustrato sólido a través del CTO.