Silenciamiento de expresión de quinasa tipo polo usando ARN interferente.

Una molécula modificada de ARNip para silenciar la expresión quinasa 1 tipo polo (PLK-1),

en la que la molécula modificada de ARNip comprende una hebra con sentido que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº 400, una hebra antisentido complementaria, y una región bicatenaria de al menos 15 nucleótidos de longitud, y en la que la hebra antisentido comprende uno o más nucleótidos modificados en la región bicatenaria seleccionados entre el grupo que consiste en nucleótidos de 2'OMe-guanosina, nucleótidos de 2'OMe-uridina, y mezclas de los mismos.

Silenciamiento de expresión de quinasa tipo polo usando ARN interferente Antecedentes de la invención

La proliferación celular y la muerte celular programada desempeñan tareas importantes en el crecimiento y desarrollo de un organismo. En enfermedades proliferativas tales como cáncer, los procesos de proliferación celular y/o muerte celular programada a menudo están alterados. Por ejemplo, una célula cancerosa puede tener división celular no regulada a través de sobreexpresión de un regulador positivo del ciclo celular o la pérdida de un regulador negativo del ciclo celular, quizá por mutación. Como alternativa, una célula cancerosa puede haber perdido la capacidad de experimentar muerte celular programada a través de la sobreexpresión de un regulador negativo de la apoptosis. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar nuevos agentes terapéuticos que restauren los procesos de control en puntos determinados y muerte celular programada en células cancerosas.

La interferencia de ARN (¡ARN) es un proceso evolutivamente conservado en que el reconocimiento de ADN bicatenario (ARNbc) finalmente conduce a supresión post-transcripcional de expresión génica. Esta supresión está mediada por ARNbc corto, también llamado ARN interferente pequeño (ARNip), que induce degradación específica de ARNm a través de apareamiento de bases complementario. En varios sistemas modelo, esta respuesta natural se ha desarrollado en una herramienta poderosa para la investigación de la función génica (véase, por ejemplo, Elbashir et al., Genes Dev., 15:188-2 (21); Hammond et al., Nat. Rev. Genet., 2:11-119 (21)). Más recientemente, se descubrió que la introducción de dúplex de ARNbc sintéticos de 21 nucleótidos en células de mamífero podría silenciar de forma eficaz la expresión génica. Aunque el mecanismo preciso aún no está claro, la ¡ARN ofrece un nuevo modo para inactivar genes de interés. En particular, para el tratamiento de trastornos neoplásicos tales como cáncer, la ¡ARN proporciona un nuevo enfoque potencial para modular (por ejemplo, reducir) la expresión de ciertos genes, por ejemplo, una molécula anti-apoptótica, un factor de crecimiento, un receptor de factor de crecimiento, una proteína del huso mitótico, una proteína del ciclo celular, un factor angiogénico, un oncogén, un transductor de señales intracelulares, una chaperona molecular, y combinaciones de los mismos.

Una de estas dianas es el gen de la quinasa 1 tipo polo (PLK-1), que codifica un miembro de una familia de serina/treonina proteína quinasas conocidas como quinasas tipo polo (véase, por ejemplo, Nigg, Curr. Opin. Cell. Biol., 1:776-783 (1998)). En eucariotas, la progresión regulada a través del ciclo celular está controlada por un grupo de genes cuya expresión fluctúa en todo el ciclo. Las quinasas dependientes de ciclina y subunidades reguladoras asociadas, las ciclinas, son los reguladores principales del ciclo celular. Estos complejos heterodiméricos actúan fosforilando dianas corriente abajo que, a su vez, desencadenan eventos de señalización que liberan proteínas nucleares necesarias para entrar en posteriores fases del ciclo celular. Las quinasas tipo polo tales como PLK-1 contribuyen a la activación e inactivación de estos complejos heterodiméricos.

Según progresan las células a través del ciclo celular, las quinasas tipo polo experimentan fluctuaciones en abundancia, actividad, y localización para controlar múltiples fases del ciclo celular (Hamanaka et al., J. Biol. Chem., 27:2186-2191 (1995)). Esta familia de quinasas también funciona en la maduración del centrosoma (Lañe et al., J. Cell. Biol., 135:171-1713 (1996)), la formación del huso bipolar (Golsteyn et al., J. Cell. Biol., 129:1617-1628 (1995)), la adaptación de puntos de control de daños en el ADN (Arnaud et al., Chromosoma, 17:424-429 (1998)), y la regulación del complejo promotor de anafase (Kotani et al., Mol. Cell, 1:371-38 (1998)).

PLK-1 fue el primer miembro de esta familia de quinasas en identificarse como equivalente de mamífero al gen polo de Drosophila melanogaster, necesario para pasar a través de mitosis (Golsteyn et al., J. Cell. Sci., 17:159-1517 (1994); Hamanaka et al., Cell. Growth Differ., 5:249-257 (1994); Holtrich et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 91:1736-174 (1994); Lake et al., Mol. Cell. Biol., 13:7793-781 (1993)). La expresión de PLK-1 demostró correlacionarse con la actividad mitótica de las células (Golsteyn et al., J. Cell. Sci., 17:159-1517 (1994); Lake et al., Mol. Cell. Biol., 13:7793-781 (1993)) y estar elevada en tumores de varios orígenes incluyendo pulmón, colon, estomago, músculo liso, y esófago (Holtrich et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 91:1736-174 (1994)). La sobreexpresión o expresión constitutiva de PLK-1 también ha demostrado inducir transformación maligna de células de mamífero (Mundt et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 239:377-385 (1997); Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 234:397-45 (1997)). La microinyección de ARN antisentido de PLK-1 en células de fibroblasto de ratón NIH3T3 en crecimiento demostró bloquear la incorporación de timidina tritiada, lo que sugiere que la expresión de PLK-1 está restringida y es necesaria para las células en proliferación (Hamanaka et al., Cell. Growth Differ., 5:249-257 (1994)).

Se encuentra soporte adicional para esta conclusión en estudios que muestran que niveles elevados de expresión de PLK-1 son indicadores pronóstico significativos de cáncer pulmonar no microcítico (Wolf et al., Oncogene, 14:543-549 (1997)), cáncer de mama y pulmón (Yuan et al., Am. J. Pathol., 15:1165-1172 (1997)), carcinoma esofágico (Tokumitsu et al., Int. J. Oncol., 15:687-692 (1999)), y carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello (Knecht et al., Cáncer Res., 59:2794-2797 (1999)). La modulación farmacológica de la actividad, expresión, o función de PLK-1 puede, por lo tanto, ser un punto apropiado de intervención terapéutica en afecciones patológicas.

Actualmente, no se conocen agentes terapéuticos que inhiban la síntesis de PLK-1 y las estrategias de investigación dirigidas a la modulación de la función de PLK-1 han implicado el uso de anticuerpos y oligonucleótidos antisentido. Por ejemplo, la inhibición de la expresión de PLK-1 usando oligonucleótidos antisentido provocó la pérdida de viabilidad celular en células A549 cultivadas y actividad antitumoral en xenoinjertos A549 de ratones desnudos (Elez et al., Biochem. Biophys. Res. Common., 29:352-356 (2)). Asimismo, la patente de Estados Unidos N° 6.96.186 describe la inhibición de la expresión de PLK-1 usando oligonucleótidos antisentido en un sistema de cultivo celular in vitro. Sin embargo, estas estrategias están sin ensayar como protocolos terapéuticos y por consiguiente sigue existiendo una necesidad desde hace tiempo de agentes capaces de inhibir de forma eficaz la función PLK-1 in vivo. El documento US 27/265438 y el documento CN 165145 describen ARN interferentes pequeños (ARNip) que aborden PLK-1. El documento VVO 27/5133 describe moléculas ARNip modificadas y usos de las mismas. Judge et al. (26) Mol. Ther., 13(3), 494-55 describe el diseño de un ARNip sintético no inflamatorio que medie el potente silenciamiento génico in vivo. Zimmerman et al. (26) Nature, 441, 111-114 describe silenciamiento génico mediado por ¡ARN en primates.

Por tanto, existe la necesidad de composiciones y métodos para modular específicamente la expresión de PLK-1. La presente invención aborda estas y otras necesidades.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una molécula modificada de ARNip para silenciar la expresión de la quinasa 1 tipo polo (PLK-1), donde la molécula modificada de ARNip comprende una hebra con sentido que consiste en una secuencia de ácido nucleico de la SEC ID N° 4, una hebra antisentido complementaria, y una región bicatenaria de al menos 15 nucleótidos de longitud, y donde la hebra antisentido comprende uno o más nucleótidos modificados en la región bicatenaria seleccionados entre el grupo que consiste en nucleótidos de 2'OMe-guanosina, nucleótidos de 2'OMe-uridina, y mezclas de los mismos. En este documento se describen partículas de ácido nucleico-lípido estables en suero (por ejemplo, SNALP) que comprenden una molécula de ARN interferente descrita en este documento, un lípido catiónico, y un lípido no catiónico, que pueden comprender adicionalmente un lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas. Se describen adicionalmente en este documento métodos para silenciar la expresión del gen PLK-1 administrando una molécula de ARN interferente descrita en este documento a un sujeto mamífero. También se describen adicionalmente en este documento métodos para identificar... [Seguir leyendo]

1. Una molécula modificada de ARNip para silenciar la expresión quinasa 1 tipo polo (PLK-1), en la que la molécula modificada de ARNip comprende una hebra con sentido que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID N° 4, una hebra antisentido complementaria, y una región bicatenaria de al menos 15 nucleótidos de longitud,

y en la que la hebra antisentido comprende uno o más nucleótidos modificados en la región bicatenaria seleccionados entre el grupo que consiste en nucleótidos de 2'OMe-guanosina, nucleótidos de 2'OMe-uridina, y mezclas de los mismos.

2. La molécula modificada de ARNip de la reivindicación 1, en la que:

(a) la molécula modificada de ARNip comprende un saliente 3' en una o ambas hebras de la molécula modificada de ARNip, opcionalmente en la que uno o más de los nucleótidos en el saliente 3' comprenden nucleótidos modificados; o

(b) menos del 3% de los nucleótidos en la región bicatenaria comprenden nucleótidos modificados; o

(c) la molécula modificada de ARNip es menos inmunoestimuladora que una secuencia correspondiente de ARNip no modificado.

3. La molécula modificada de ARNip de la reivindicación 1, en la que la hebra antisentido consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID N° 43.

4. La molécula modificada de ARNip de la reivindicación 1, en la que del 15% al 3% de los nucleótidos en el ARNip modificado comprende nucleótidos modificados.

5. La molécula modificada de ARNip de la reivindicación 1, en la que la molécula modificada de ARNip comprende una región bicatenaria de 19 nucleótidos de longitud.

6. La molécula modificada de ARNip de la reivindicación 1, en la que la hebra antisentido comprende al menos un nucleótido de 2'OMe-guanosina y al menos un nucleótido de 2'OMe-uridina en la región bicatenaria.

7. Un sistema de vehículo que comprende un ARNip modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, opcionalmente en el que el sistema de vehículo se selecciona entre el grupo que consiste en una partícula de ácido nucleico-lípido, un liposoma, una micela, un virosoma, un complejo de ácido nucleico, y mezclas de los mismos,

tal como en el que el sistema de vehículo es una partícula de ácido nucleico-lípido que comprende:

una molécula modificada de ARNip de una cualquiera de las reivindicación 1 a 6; un lípido catiónico; y un lípido no catiónico.

8. El sistema de vehículo de la reivindicación 7 que es una partícula de ácido nucleico-lípido que comprende dicho ARNip modificado, un lípido catiónico y un lípido no catiónico, en el que:

(a) el lípido catiónico es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en 1,2-dilinoleiloxi-N,N-

dimetilamino-propano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), cloruro de N,N-dioleil- N,N-dimetilamonio (DODAC), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(1-(2,3- dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), diestearildimetilamonio (DSDMA), cloruro de N-(1-(2,3- dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloxipropilamina (DODMA), 3-(N-(N',N'- dimetilaminoetano)-carbamoil)colesterol (DC-Chol), bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N- hidroxietil amonio (DMRIE), 2,3-dioleiloxi-N-[2(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-

propanaminiotrifluoroacetato (DOSPA), dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS), 3-dimetil-amino-2-(colest-5-en- 3-beta-oxibutan-4-oxi)-1-(cis,cis-9,12-octadecadienoxi)propano (CLinDMA), [5'-(colest-5-en-3-beta-oxi)-3'- oxapentoxi)-3-dimeti-1-(cis,cis-9',1-2'-octadecadienoxi)propano (CpLinDMA), N,N-dimetil-3,4-

dioleiloxibencilamina (DMOBA), 1,2-N,N'-dioleilcarbamil-3-dimetilamino-propano (DOcarbDAP), 2,3-dilinoleoiloxi- N,N-dimetilpropilamina (DLinDAP), 1,2-N,N'-dilinoleilcarbamil-dimetilaminopropano (DLincarbDAP), 1,2- dilinoleoilcarbamil-3-dimetilaminopropano (DLinCDAP), y una mezcla de los mismos; o

(b) el lípido no catiónico es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoil-fosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil- fosfatidiletanolamina (POPE), palmitoiloleiol-fosfatidilglicerol (POPG), dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), dipalmitoil-fosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE), monometil-fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina, dielaidoil-fosfatidiletanolamina (DEPE), estearoiloleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE), fosfatidilcolina de huevo (EPC), colesterol, y una mezcla de los mismos; o

(c) dicha partícula de ácido nucleico-lípido comprende adicionalmente un conjugado polietilenglicol (PEG)-lípido, un conjugado poliamida (ATTA)-lípido, o una mezcla de los mismos, que es opcionalmente

(i) un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en un PEG-diacilglicerol, un PEG-dialquiloxipropilo, un PEG-fosfolípido, un PEG-ceramida, y una mezcla de los mismos, o

(ii) un conjugado polietilenglicol (PEG)-dialquiloxipropilo (PEG-DAA), preferiblemente un conjugado PEG- dimiristiloxipropilo (PEG-DMA), o

(iii) del 1% en mol al 15% en mol, preferiblemente del 4% en mol al 15% en mol, más preferiblemente del 4% en mol al 1% en mol, del lípido total presente en la partícula; o

(d) el lípido catiónico comprende del 5% en mol al 65% en mol del lípido total presente en la partícula; o

(e) el lípido no catiónico comprende una mezcla de un fosfolípido y colesterol o un derivado del mismo, en el que el fosfolípido comprende del 4% en mol al 1% en mol, preferiblemente del 5% en mol al 9% en mol, del lípido total presente en la partícula, y en el que el colesterol o derivado del mismo comprende del 3% en mol al 4% en mol, preferiblemente del 3% en mol al 35% en mol, del lípido total presente en la partícula; o

(f) el lípido no catiónico comprende colesterol o un derivado del mismo que comprende del 3% en mol al 45% en mol, preferiblemente del 35% en mol al 4% en mol, del lípido total presente en la partícula; o

(g) la molécula modificada de ARNip está completamente encapsulada en la partícula de ácido nucleico-lípido; o

(h) la partícula de ácido nucleico-lípido tiene una proporción másica lípido:ARNip de 5 a 15; o

(i) la partícula de ácido nucleico-lípido tiene un diámetro medio de 5 nm a 15 nm.

9. La partícula de ácido nucleico-lípido de la reivindicación 8, en la que el fosfolípido de (e) es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), palmitoiloleiolfosfatidilglicerol (POPG), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoil- fosfatidiletanolamina (DMPE), diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), monometilfosfatidiletanolamina, dimetilfosfatidiletanolamina, dielaidoilfosfatidiletanolamina (DEPE), estearoiloleoilfosfatidiletanolamina (SOPE), fosfatidilcolina de huevo (EPC), y una mezcla de los mismos.

1. La partícula de ácido nucleico-lípido de la reivindicación 8, en la que el derivado de colesterol de (e) o (f) es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en colestanol, colestanona, colestenona, coprostanol, colesteril- 2'-hidroxietil éter, y colesteril-4'-hidroxibutil éter.

11. Una composición farmacéutica que comprende:

(i) una molécula modificada de ARNip de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; o

(ii) una partícula de ácido nucleico-lípido de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 1 que comprende dicho ARNip modificado, un lípido catiónico y un lípido no catiónico; y

(iii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Un método in vitro para Introducir un ARNip que silencie la expresión de qulnasa 1 tipo polo (PLK-1) en una célula, comprendiendo el método:

poner en contacto la célula con una molécula modificada de ARNip de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una partícula de ácido nucleico-lípido de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 1 que comprende dicho ARNip modificado, un lípido catiónico y un lípido no catiónico.

13. Una molécula modificada de ARNip de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una partícula de ácido nucleico-lípido de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 1 que comprende dicho ARNip modificado, un lípido catiónico y un lípido no catiónico, para su uso en un método para el suministro in vivo de un ARNip que silencie la expresión de quinasa 1 tipo polo (PLK-1), comprendiendo dicho método administrar dicha molécula de ARNip o dicha partícula de ácido nucleico-lípido a un sujeto mamífero in vivo.

14. La molécula modificada de ARNip o partícula de ácido nucleico-lípido para el uso de la reivindicación 13 en la que:

(a) la administración se selecciona entre el grupo que consiste en oral, intranasal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-articular, intralesional, intratraqueal, subcutánea, e intradérmica; o

(b) dicho método es para tratar un cáncer en un sujeto mamífero que lo necesita, opcionalmente en el que el cáncer es cáncer de hígado, tal como carcinoma hepatocelular.

15. Un ARNip modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un sistema de vehículo de acuerdo con la reivindicación 7, para su uso en un método in vivo para sensibilidad una célula cancerosa a los efectos de un fármaco quimioterapéutico, comprendiendo el método:

poner en contacto la célula cancerosa con dicha molécula de ARNip antes de administrar el fármaco quimioterapéutico; opcionalmente en el que:

(a) la célula cancerosa está en un mamífero; o

(b) el fármaco quimioterapéutico se selecciona entre el grupo que consiste en paclitaxel, fluorouracilo (5-FU), irinotecano, sorafenib, y mezclas de los mismos.