Reovirus que tienen secuencias modificadas.

Un reovirus de tipo 3 modificado que comprende:

un polipéptido lambda-3 que tiene las siguientes modificaciones de aminoácidos:

una Leu en el residuo 979; una Val en el residuo 214, una Ala en el residuo 267, una Thr en el residuo 557, una Lys en el residuo 755, una Met en el residuo 756, una Pro en el residuo 926, una Pro en el residuo 963, una Arg en el residuo 1045, y una Val en el residuo 1071, contados con relación a SEQ ID NO: 23 (Registro de GenBank No. M24734.1).

Reovirus que tienen secuencias modificadas Campo técnico

Esta invención se refiere a reovirus que tienen secuencias modificadas.

Antecedentes

El nombre reovirus se deriva de una abreviatura de virus respiratorio y entérico huérfano, que refleja que los aislados ¡nidales vinieron de tractos respiratorios y entéricos humanos, no asociados con enfermedad grave. Los reovirus tienen un genoma de ARN bicatenario, segmentado. Los viriones miden 60-80 nm en diámetro y poseen dos armazones concéntricas de cápside, cada una de las cuales es un icosaedro. El genoma de reovirus de mamíferos consiste de un ARN bicatenario en 10 segmentos discretos con un tamaño total de genoma de -23.5 kbp. Los segmentos individuales de ARN varían en tamaño.

Tres tipos de reovirus, serológicamente distintos pero relacionados, han sido recobrados de especies de mamíferos: tipo 1 (cepas representativas incluyen, por ejemplo, Lang (T1L)), tipo 2 (cepas representativas incluyen, por ejemplo, Jones (T2J)) y tipo 3 (cepas representativas incluyen, por ejemplo, Dearing o Abney (T3D o T3A, respectivamente)). Los tres serotipos son fácilmente identificables sobre la base de ensayos de neutralización e inhibición de hemaglutinina (véase, por ejemplo, Sabin, 1959, Science, 130:966; Fields, et al., 1996, Fundamental irology, 3a. Ed., Lippincott-Raven; Rosen, 1960, Am. J. Hyg., 71:242; y Stanley, 1967, Br. Med. Bull., 23:150).

US2006/0165724 divulga métodos de producir reovirus mediante el cultivo de reovirus en células HEK 293.

La referencia "Mutaciones en la región de palma de polimerasa de virus de ARN de sentido positivo dan lugar a fenotipo adecuado", Gallei, A. et al, J.Gen.Vir. (2006), 87, 3631-3636 describe experimentos en los cuales las mutaciones en la región de palma de una polimerasa de virus de ARN de sentido positivo dan lugar a fenotipo atenuado.

Resumen

La invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

En la presente se proporcionan reovirus que tienen secuencias de polipéptido y ácido nucleico modificadas. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen reovirus que tienen una secuencia modificada, como también métodos para usar tales reovirus.

En un aspecto, la invención proporciona un reovirus que tiene un polipéptido lambda-3 que tiene modificaciones de aminoácido tal como se define en la reivindicación 1.

En una modalidad, el polipéptido lambda-3 incluye la secuencia mostrada en SEQ ID NO:19.

El reovirus puede comprender además una o más modificaciones de aminoácido en el polipéptido sigma-3 tal como se define en la reivindicación 4. En una modalidad, el polipéptido sigma-3 incluye la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 15.

El reovirus puede comprender además una o más modificaciones de aminoácido en el polipéptido mu-1 tal como se define en la reivindicación 2. En una modalidad, el polipéptido mu-1 incluye la secuencia mostrada en SEQ ID NO:17.

El reovirus puede comprender además la modificación de aminoácido en el polipéptido mu-2 tal como se define en la reivindicación 3. En una modalidad, el polipéptido mu-2 incluye la secuencia mostrada en SEQ ID NO:16.

Un reovirus, tal como se describe en la presente, puede incluir un polipéptido sigma-2 de reovirus tal como se define en la reivindicación 9. En una modalidad, el polipéptido sigma-2 incluye la secuencia mostrada en SEQ ID NO:12.

En otro aspecto, la invención proporciona un reovirus que tiene un segmento de genoma L1 tal como se define en la reivindicación 11.

En una modalidad, el segmento de genoma L1 incluye la secuencia mostrada en SEQ ID NO:8.

El reovirus puede comprender además las modificaciones de ácido nucleico, una o más, en el segmento de genoma S4 tal como se define en la reivindicación 14. En una modalidad, el segmento de genoma S4 Incluye la secuencia mostrada en SEQ ID NO:4.

El reovirus puede comprender además la modificación de ácido nucleico en el segmento de genoma M2 tal como se define en la reivindicación 12. En una modalidad, el segmento de genoma M2 incluye la secuencia mostrada en SEQ ID NO:6.

El reovirus puede comprender además la modificación de ácido nucleico en el genoma M1 tal como se define en la reivindicación 13. En una modalidad, el segmento de genoma M1 incluye la secuencia mostrada en SEQ ID NO:5.

En algunas modalidades, un reovirus, tal como se describe en la presente, es recombinante. En determinadas modalidades, un reovirus tal como se describe en la presente incluye segmentos genómicos que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID NOs:1-10 o los polipéptidos mostrados en SEQ ID NOs:11, 12, y 16-21, y cualquiera o ambas SEQ ID NO:13 o 14. En una modalidad, un reovirus, tal como se divulga en la presente, se identifica como registro de IDAC No. 190907-01.

Un reovirus tal como se divulga en la presente exhibe en términos generales una ventaja de crecimiento sobre un reovirus que no contiene una modificación correspondiente. Las ventajas de crecimiento representativo incluyen, pero no se limitan a, una tasa incrementada de lisis; un tamaño incrementado de formación de placas; una tasa incrementada de replicación de ARN; una tasa incrementada de transcripción de ARN; una tasa incrementada de traducción; una tasa incrementada de ensamblaje y/o empaque de virus; un número incrementado de progenie viral; una capacidad incrementada de un reovirus de ser absorbido por una célula hospedera; una capacidad incrementada o mejorada para quitar recubrimiento; lisis de célula mejorada o inducción a muerte celular que incluye apoptosis, necrosis o autofagia; una capacidad mejorada de infectar, lisar y matar líneas de células neoplásicas humanas; inmunogenicidad disminuida en células de mamíferos; susceptibilidad diferencial a sensibilidad de interferón; toxicidad disminuida hacia el hospedero; interacción de medicamento mejorada; interacción de radioterapia mejorada; por la capacidad de liberar epítopos tumorales efectivos.

Puede incluirse un reovirus, tal como se describe en la presente, junto a un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico, en una composición farmacéutica. Tales composiciones farmacéuticas pueden incluir, por ejemplo, uno o más agentes quimioterapéuticos y/o uno o más agentes inmunosupresores.

La divulgación proporciona métodos para hacer un reovirus mejorado. Tales métodos generalmente incluyen los pasos de modificar la secuencia de ácido nucleico del reovirus, y seleccionar uno o más reovirus mejorados. El paso de modificación puede incluir, por ejemplo, la mutagénesis del reovirus. Tipos representativos de mutagénesis incluyen, sin limitación, mutagénesis dirigidos al sitio y mutagénesis química. El paso de modificación puede incluir cultivar el reovirus en una línea celular humana.

Un reovirus mejorado, hecho de acuerdo con los métodos divulgados en la presente, puede seleccionarse para una tasa incrementada de lisis; un tamaño incrementado de formación de placa; una tasa incrementada de replicación de ARN; una tasa incrementada de transcripción de ARN; una tasa incrementada de traducción; una tasa incrementada de ensamblaje y/o empaque de virus; un número incrementado de progenie viral; una capacidad incrementada de un reovirus para ser absorbido por una célula hospedera; una capacidad incrementada o mejorada para retirar recubrimiento; lisis celular mejorada o inducción a muerte celular que incluye apoptosis, necrosis o autofagia; una capacidad mejorada de infectar, lisar y matar líneas celulares neoplásicas humanas; inmunogenicidad reducida en células de mamíferos; susceptibilidad diferencial a sensibilidad de interferón; toxicidad reducida hacia el hospedero; interacción mejorada de medicamentos; interacción mejorada de radioterapia; o la capacidad de liberar epítopos tumorales efectivos.

En otro aspecto, la invención proporciona el reovirus tal como se define por las reivindicaciones 1 a 21 para uso en métodos de tratamiento de un desorden proliferativo en un paciente. Tales métodos incluyen en términos generales administrar al paciente un reovirus modificado como se describe en la presente o una composición farmacéutica que contiene tal reovirus modificado. De manera típica, el reovirus se administra en una cantidad efectiva para causar oncólisis, y puede administrarse más de una vez. Las rutas representativas de administración incluyen, por ejemplo, inyección directa, por vía intravenosa, intravascular, intratecal, intramuscular, cutánea, intraperitoneal, tópica, oral, rectal, vaginal, nasal o mediante inhalación. Los métodos para tratar un desorden proliferativo como se describen en la presente pueden acompañarse por uno o más procedimientos tales... [Seguir leyendo]

1. Un reovirus de tipo 3 modificado que comprende:

un polipéptido lambda-3 que tiene las siguientes modificaciones de aminoácidos: una Leu en el residuo 979; una Val en el residuo 214, una Ala en el residuo 267, una Thr en el residuo 557, una Lys en el residuo 755, una Met en el residuo 756, una Pro en el residuo 926, una Pro en el residuo 963, una Arg en el residuo 1045, y una Val en el residuo 1071, contados con relación a SEQ ID NO: 23 (Registro de GenBank No. M24734.1).

2. El reovirus de la reivindicación 1, donde el reovirus comprende además un polipéptido mu-1 que tiene al menos una modificación de aminoácido, en cuyo caso la modificación de aminoácido, al menos una, comprende una Asp en el residuo 73 contada en relación con el registro de GenBank No. M20161.1.

3. El reovirus de la reivindicación 1, donde el reovirus comprende además un polipéptido mu-2 que tiene al menos una modificación de aminoácido, en cuyo caso la modificación de aminoácido, al menos una, comprende una Ser en el residuo 528 contada en relación al registro de GenBank No. AF461684.1.

4. El reovirus de la reivindicación 1, donde el reovirus comprende además un polipéptido sigma-3 que tiene una o más modificaciones de aminoácido, en cuyo caso las modificaciones de aminoácido, una o más, se seleccionan del grupo que consiste en una Leu en el residuo 14, una Lys en el residuo 198, o cualquier combinación de las mismas, contada en relación al registro de GenBank No. K02739, en cuyo caso cuando la secuencia de aminoácidos comprende una Leu en el residuo 14, la secuencia de aminoácidos comprende además al menos una modificación adicional en la secuencia de aminoácidos.

5. El reovirus de la reivindicación 1, en cuyo caso el polipéptido lambda-3 comprende SEQ ID NO:19.

6. El reovirus de la reivindicación 4, en cuyo caso el polipéptido sigma-3 comprende SEQ ID NO:15.

7. El reovirus de la reivindicación 2 en cuyo caso el polipéptido mu-1 comprende SEQ ID NO:17.

8. El reovirus de la reivindicación 3 en cuyo caso el polipéptido mu-2 comprende SEQ ID NO:16.

9. El reovirus de la reivindicación 1, donde el reovirus comprende además un polipéptido sigma-2 de reovirus, en cuyo caso el polipéptido sigma-2 comprende una Cys en una o más de las posiciones 70, 127, 195, 241, 255, 294, 296, o 340, contadas en relación a SEQ ID NO:30 (registro de GenBank No. NP_694684.1); o en cuyo caso el polipéptido sigma-2 comprende SEQ ID NO:12.

10. El reovirus de la reivindicación 1, en cuyo caso el reovirus comprende polipéptidos tal como se describen en SEQ ID NOs:11, 12, y 16-21, y al menos una de SEQ ID NO:13 o 14.

11. Un reovirus de tipo 3 modificado que comprende:

un segmento de genoma L1 que tiene las siguientes sustituciones de ácido nucleico: una C en posición 2953; una G en posición 817, una A en posición 1687, una G en posición 2283, una ATG en posiciones 2284-2286, una C en posición 2794, una C en posición 2905, y una A en posición 3153, contadas en relación a SEQ ID NO:22 (registro de GenBank No. M24734.1).

12. El reovirus de la reivindicación 11, que comprende además un segmento de genoma M2 que tiene al menos una modificación de ácido nucleico, en cuyo caso la modificación de ácido nucleico, al menos una, comprende una C en posición 248, contada en relación a SEQ ID NO:26 (registro de GenBank No. M20161.1).

13. El reovirus de la reivindicación 11, que comprende además un segmento de genoma M1 que tiene al menos una modificación de ácido nucleico, en cuyo caso la modificación de ácido nucleico, al menos una, comprende una T en posición 1595, contada en relación a SEQ ID NO:28 (registro de GenBank No. AF461684.1).

14. El reovirus de la reivindicación 11, que comprende además un segmento de genoma S4 que tiene una o más

modificaciones de ácido nucleico, en cuyo caso las modificaciones de ácido nucleico, una o más, en el segmento de genoma S4 se seleccionan del grupo consistente en una A en posición 74 y una A en posición 624, contada en relación a SEQ ID NO:24 (registro de GenBank No. K02739).

15. El reovirus de la reivindicación 11, en cuyo caso el segmento de genoma L1 comprende SEQ ID NO:8.

16. El reovirus de la reivindicación 14, en cuyo caso el segmento de genoma S4 comprende SEQ ID NO:4.

17. El reovirus de la reivindicación 12, en cuyo caso el segmento de genoma M2 comprende SEQ ID NO:6.

18. El reovirus de la reivindicación 13, en cuyo caso el segmento de genoma M1 comprende SEQ ID NO:5.

19. El reovirus de la reivindicación 11, en cuyo caso el reovirus comprende segmentos genómicos que tienen las secuencias tal como se describen en SEQ ID NOs:1-10.

20. El reovirus de cualquiera de las reivindicaciones 1-20, en cuyo caso el reovirus es recombinante.

21. El reovirus que tiene registro IDAC No. 190907-01.

22. Un polipéptido que comprende

una secuencia de aminoácidos de un polipéptido lambda-3 de reovirus, en cuyo caso la secuencia del polipéptido lambda-3 de reovirus comprende las siguientes modificaciones de aminoácidos: una Leu en el residuo 979; una Val en el residuo 214, una Ala en el residuo 267, una Thr en el residuo 557, una Lys en el residuo 755, una Met en el residuo 756, una Pro en el residuo 926, una Pro en el residuo 963, una Arg en el residuo 1045, y una Val en el residuo 1071, contada en relación a SEQ ID NO:23 (Registro de GenBank No: M24734.1).

23. El polipéptido de la reivindicación 22, en cuyo caso el polipéptido lambda-3 comprende SEQ ID NO:19.

24. Una molécula de ácido nucleico que comprende

Una secuencia de ácido nucleico de un segmento de genoma L1 de reovirus, en cuyo caso la secuencia de ácido nucleico del segmento de genoma L1 de reovirus comprende las siguientes sustituciones de ácido nucleico: una C en posición 2953; una T en posición 660, una G en posición 817, una A en posición 1687, una G en posición 2283, una ATG en posiciones 2284-2286, una C en posición 2794, una C en posición 2905, una A en posición 3153, y una G en posición 3231, contadas en relación a SEQ ID NO:22 (registro de GenBank No:M24734.1).

25. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 24, en cuyo caso el segmento de genoma L1 comprende SEQ ID NO:8.

26. Una composición farmacéutica que comprende un reovirus y un vehículo farmacéuticamente aceptable, que comprende además opcionalmente uno o más agentes quimloterapéutlcos y/o uno o más agentes inmunosupresores, en cuyo caso el reovirus es:

un reovirus de acuerdo con las reivindicaciones 1-21.

27. Un kit que comprende un reovirus y uno o más agentes, en cuyo caso opcionalmente los agentes son agentes quimioterapéuticos o agentes inmunosupresores, en cuyo caso el reovirus es:

un reovirus de acuerdo con las reivindicaciones 1-21.

28. Un reovirus para usar al tratar un desorden prollferativo en un paciente, en cuyo caso el reovirus es: un reovirus de acuerdo con las reivindicaciones 1-21.

29. Una composición farmacéutica tal como se reivindica en la reivindicación 26 para usar en el tratamiento de un desorden proliferativo en un paciente.