Método para extracción de virus de un cultivo celular.

Un método para producir reovirus a partir de un cultivo de células,

que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un cultivo de células que ha sido infectado por el reovirus;

(b) extraer el reovirus de las células mediante la adición de un detergente al cultivo de células e incubando durante un período de tiempo en el que se selecciona el detergente del grupo que consiste en Triton X-100, Tween 20, NP- 40 y desoxicolato de sodio;

(c) recoger el reovirus; y

(d) formar el reovirus en una composición que sea adecuada para la administración clínica, que comprende un excipiente y/o portador farmacéuticamente aceptable;

en donde un cultivo de células significa una población de células cultivadas como se encuentra en sus condiciones de cultivo

en donde las células no se sedimentaron y luego se resuspendieron;

en donde la etapa (c) comprende la remoción de los restos celulares por filtración; y

en donde las células son células 293 de riñón embrionario humano (HEK 293).

Método para extracción de virus de un cultivo celular Campo de la invención

Esta invención se refiere a un método de extracción de virus de un cultivo celular. En particular, el método es útil para la extracción de virus infecciosos el cual es adecuado para administración clínica a mamíferos, incluyendo seres humanos.

El documento WO 99/08692A1, publicado el 25 de febrero, 1999 divulga métodos para tratar una neoplasia utilizando reovirus. Los reovirus usados en el estudio se propagaron en cultivos en suspensión de células L y se purificaron usando un método de congelación - descongelación.

Antecedentes de la invención

Debido al vasto número de enfermedades provocadas por virus, la virología ha sido un campo intensamente estudiado. Siempre ha habido demanda para producir virus eficientemente con el fin de aislar y purificar proteínas virales, para generar vacunas o para proporcionar virus infecciosos para estudios de laboratorio. Recientemente, el nuevo desarrollo de terapia de virus ha requerido además de una producción eficiente de virus infecciosos.

La terapia con reovirus es un ejemplo de terapia con un virus. El reovirus es un virus de ARN bicatenario capaz de enlazarse a una multitud de células. Sin embargo, la mayoría de las células no son susceptibles a infección por reovirus y el enlace del reovirus a su receptor celular no da como resultado una replicación viral o producción de partículas virales. Esta es probablemente la razón por la que no se sabe que el reovirus está asociado con alguna enfermedad particular.

Se descubrió recientemente que las células transformadas con el oncogén ras se vuelven susceptibles a infección por reovirus, en tanto que sus contrapartes sin transformar no lo son (Strong et al., 1998). Por ejemplo, cuando células NIH 3T3 resistentes al reovirus fueron transformadas con Ras o Sos activadas, una proteína que activa Ras, mejoró la infección con reovirus. En forma similar, los fibroblastos de ratón que son resistentes a la infección con reovirus se vuelven susceptibles después de transfección con el gen receptor de EGF o el oncogén v-erbB, los cuales activan la ruta de ras (Strong et al., 1993; Strong et al., 1996). Por lo tanto, el reovirus puede infectar selectivamente y replicarse en células con una ruta de Ras activada.

El oncogén ras es el responsable de un gran porcentaje de tumores de mamíferos. Las mutaciones activadoras del gen ras mismo ocurren en aproximadamente 30% de todos los tumores humanos (Bos, 1989), principalmente en carcinomas pancreático (90%), colorrectal esporádico (50%) y de pulmón (40%), así como leucemia mieloide (30%). La activación de factores secuencia arriba o secuencia abajo de ras en la ruta de ras, está también asociada con el tumor. Por ejemplo, la sobreexpresión de HER2/Neu/ErbB2 o el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) es común en cáncer de mama (25 - 30%), y la sobreexpresión del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o el receptor de EGF es prevaleciente en gliomas y glioblastomas (40 - 50%). Se sabe que tanto el receptor de EGF como el receptor de PDGF activan a ras después de enlazarse a su respectivo ligando y v-erbB codifica un receptor constitutivamente activado que carece del dominio extracelular.

Puesto que un gran número de tumores humanos son explicados por una alteración genética del protooncogén ras o una alta actividad de Ras, la terapia con reovirus es una nueva terapia promisoria para tales condiciones (Coffey et al., 1998). La terapia con reovirus es altamente selectiva para células tumorales asociadas con Ras y deja a las células normales sin infectar. Esta terapia tiene amplias aplicaciones y puede ser usada tanto en animales humanos como no humanos.

Con el fin de producir reovirus apropiados para administración clínica, son necesarios métodos rápidos y eficientes para producir reovirus en células cultivadas. Además, el método tradicional de extracción de virus de células cultivadas es tedioso y toma mucho tiempo, tornando el costo de la producción del virus demasiado alto. Por consiguiente, también se necesita un método mejorado de extracción del virus.

Resumen de la invención

La presente invención está dirigida a un método para extraer virus de un cultivo de células. Los virus son extraídos tradicionalmente de células mediante múltiples rondas de congelación - descongelación, seguido por purificación con gradientes de densidad y ultracentrifugación. En la presente invención, se extraen los virus de un cultivo de células con un detergente y los rendimientos resultantes fueron mejores que aquellos obtenidos mediante congelación - descongelación. Además, esta etapa de extracción puede ser llevada a cabo a temperatura ambiente o a una

temperatura superior. En particular, la extracción se puede llevar a cabo a una temperatura conveniente tal como 25°C o 37°C y todavía producir altos títulos del virus.

La Invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.

El detergente es lo más preferiblemente Tritón X-100, en particular a una concentración final de 1%.

Este método de extracción de virus se puede llevar a cabo a cualquier temperatura por encima de congelación, particularmente por encima de 4 °C. Típicamente, la extracción puede realizarse convenientemente a temperatura ambiente, sin tener que mantener una temperatura preseleccionada. Preferiblemente, la extracción se lleva a cabo a 25 °C. Más preferiblemente, la extracción se realiza a la misma temperatura a la que se cultivan las células, por ejemplo 37 °C, de tal manera que el cultivo de células y la extracción del virus se puede realizar en la misma incubadora.

El cultivo celular se Incuba con el detergente durante un período de tiempo suficiente para romper las células. El período de Incubación es preferiblemente de 60 minutos o menos, más preferiblemente de 30 minutos o menos, y lo más preferible de 10 minutos.

La presente invención puede ser aplicada a cualquier reovirus, particularmente reovlrus de mamífero. El reovlrus de mamífero es preferiblemente un reovirus de humano, más preferiblemente un reovlrus de serotipo 3, y más preferiblemente la cepa Dearing.

Después de la extracción, se recolecta el virus. Los desechos celulares pueden ser retirados, por ejemplo mediante filtración. Para incrementar la velocidad de flujo de la filtración, se puede llevar a cabo una filtración gradual en donde una prefiltración con un tamaño de poro más grande es seguida por al menos una etapa de filtración con un tamaño de poro más pequeño. El tamaño de poro y el tipo de filtros dependen de la naturaleza del virus y de las células y pueden ser determinados por aquellos ordinariamente capacitados en la técnica. Por ejemplo, para la producción de reovirus utilizando células HEK 293/SF, se puede usar un prefiltro con un tamaño de poro de 8 o 5 pm, seguido por un filtro de 3 pm y finalmente un filtro de 0,8 pm.

El filtrado puede ser concentrado adicionalmente para reducir el volumen de la suspensión del virus. Si se desea cambiar la solución en la cual está suspendido el virus, se pueden emplear métodos tales como cromatografía de intercambio iónico o diálisis.

También se presenta aquí una composición que comprende el virus recolectado de acuerdo con la presente invención. En particular, se ofrecen composiciones virales apropiadas para administraciones clínicas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se relaciona con un método para la extracción de virus a partir de un cultivo de células. En lugar de la técnica tradicional de congelación - descongelación, se ha desarrollado un método rápido y simple que puede ser llevado a cabo convenientemente.

Antes de describir la invención en forma más detallada, se definen los términos utilizados en esta solicitud de la siguiente forma a menos que se indique lo contrario.

Definiciones

Como se usa en la presente invención, "infección viral" se refiere a la entrada de un virus a una célula y la posterior replicación del virus en la célula.

Como se usa en la presente invención, "multiplicidad de infección" se refiere a la proporción del número de virus con respecto al número de células cuando se utiliza un virus para ponerlo en contacto con las células.

Como se usa en la presente Invención, "lisis celular" se refiere al rompimiento de la membrana celular de una célula y la posterior liberación de todo o parte del contenido de la célula.

Como se usa en la presente Invención, "condiciones de cultivo" se refiere a las condiciones utilizadas en un cultivo celular, incluyendo, pero sin limitarse... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir reovirus a partir de un cultivo de células, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un cultivo de células que ha sido infectado por el reovirus;

(b) extraer el reovirus de las células mediante la adición de un detergente al cultivo de células e incubando durante un período de tiempo en el que se selecciona el detergente del grupo que consiste en Tritón X-100, Tween 20, NP- 40 y desoxicolato de sodio;

(c) recoger el reovirus; y

(d) formar el reovirus en una composición que sea adecuada para la administración clínica, que comprende un excipiente y/o portador farmacéuticamente aceptable;

en donde un cultivo de células significa una población de células cultivadas como se encuentra en sus condiciones de cultivo

en donde las células no se sedimentaron y luego se resuspendieron;

en donde la etapa (c) comprende la remoción de los restos celulares por filtración; y

en donde las células son células 293 de riñón embrionario humano (HEK 293).

2. El método de la reivindicación 1, en donde el detergente es Tritón X-100.

3. El método de la reivindicación 2, en donde la concentración final de Tritón X-100 es del 1%.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, en donde la incubación de la etapa (b) se realiza a o

por encima de la temperatura ambiente, por ejemplo en donde la incubación de la etapa (b) se realiza

aproximadamente a 25 °C o se realiza aproximadamente a 37 °C.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el cultivo se incuba con el detergente en la etapa (b) durante 60 minutos o menos, o en donde el cultivo se incuba con el detergente en la etapa (b) durante 30 minutos o menos, o en donde el cultivo se incuba con el detergente en la etapa (b) durante 10 minutos.

6. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde el reovirus es un reovirus de mamífero, por ejemplo un reovirus de humano.

7. El método de la reivindicación 6, en donde el reovirus es un reovirus humano que es un virus de serotipo 3.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el reovirus de serotipo 3 es la cepa Dearing.

9. El método de cualquier reivindicación precedente, en donde las células HEK 293 se cultivan en suspensión.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 para la producción de reovirus infecciosos, que comprende:

(a) proporcionar un cultivo de células HEK 293 que ha sido infectado por reovirus;

(b) extraer el virus de las células mediante la adición de Tritón X-100 al cultivo de células e incubación aproximadamente a 25 °C hasta aproximadamente a 37 °C durante aproximadamente 10 minutos; y

(c) recoger el reovirus,

en donde las células no se sedimentaron y luego se resuspendieron; y en donde la etapa (c) comprende la remoción de los restos celulares por filtración.

11. El método de la reivindicación 10, que comprende además una etapa de concentración después de la filtración.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además purificar el virus.

13. El método de la reivindicación 12, en donde el virus se purifica mediante cromatografía de intercambio iónico, o en donde el virus se purifica por exclusión de tamaño.