Polipéptidos de factor VII modificados y usos de los mismos.

Un polipéptido del factor VII (FVII) modificado, que comprende:

un domino Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo para efectuar unión con fosfolípidos, por lo que el polipéptido de FVII modificado muestra afinidad o unión con fosfolípidos aumentada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado que no contiene el dominio Gla heterólogo, donde:

la parte suficiente contiene 30 o más aminoácidos contiguos del dominio Gla heterólogo; y el dominio Gla heterólogo se selecciona de entre un dominio Gla en el factor IX (FIX), Factor X (FX), protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína específica de detención del Crecimiento 6 (Gas6) y proteína Z; y

una o más modificaciones de aminoácidos adicionales que aumentan la resistencia a antitrombina III (AT-III), aumentan la afinidad por el factor tisular (FT), aumentan la actividad intrínseca, aumentan la actividad catalítica o coagulante dependiente de FT, aumentan la actividad coagulante, alteran la conformación del polipéptido para alterar la zimogenicidad, aumentan la actividad catalítica o coagulante desplazando el equilibrio entre conformaciones de FVIIa altamente activo y menos activo a favor de las conformaciones altamente activas, aumentan la resistencia a proteasas, reducen la glucosilación, aumentan la glucosilación, reducen la inmunogenicidad, aumentan la estabilidad y/o facilitan el enlace de grupos químicos.

Polipéptidos de factor VII modificados y usos de los mismos

Campo de la invención 5

Se proporcionan proteínas terapéuticas modificadas. En particular se proporcionan polipéptidos del Factor VII modificados, que incluyen el Factor VIIa y otras formas de Factor VII y usos de los mismos.

Antecedentes 10

La hemostasis es el proceso fisiológico complejo que conduce al cese de la hemorragia. Las plaquetas, las proteínas del plasma, los vasos sanguíneos y las células endoteliales son los tres componentes de este proceso que desempeñan cada uno un papel importante en los acontecimientos que siguen inmediatamente a lesión tisular y que, en circunstancias normales, da como resultado la formación rápida de un coágulo. Es vital para esto la cascada 15 de coagulación, una serie de acontecimientos proteolíticos en los que ciertas proteínas del plasma (o factores de coagulación) se activan secuencialmente en una “cascada” por otro factor de coagulación previamente activado, lo que conduce a la rápida generación de trombina. Las grandes cantidades de trombina producidas en esta cascada actúan después para escindir fibrinógeno en los péptidos de fibrina que se requieren para la formación del coágulo.

Los factores de coagulación circulan como zimógenos monocatenarios inactivos, y se activan por escisión en una o más posiciones para generar una forma activada bicatenaria de la proteína. El factor VII (FVII) , una proteína del plasma dependiente de vitamina K, circula inicialmente en la sangre como un zimógeno. El zimógeno FVII se activa por escisión proteolítica en un solo sitio, Arg152-Ile153, dando como resultado una proteína de dos cadenas que están unidas por un solo enlace disulfuro (FVIIa) . El FVIIa se une con su cofactor, el factor tisular (FT) , para formar un 25 complejo en el que el FVIIa puede activar eficazmente el factor X (FX) al FXa, iniciando de este modo la serie de acontecimientos que dan como resultado la formación de fibrina y la hemostasis.

Aunque en la mayoría de los casos se consigue hemostasis normal, los defectos en el proceso pueden conducir a trastornos hemorrágicos en los que se prolonga el tiempo que tarda en formarse el coágulo. Dichos trastornos 30 pueden ser congénitos o adquiridos. Por ejemplo, la hemofilia A y B son enfermedades hereditarias caracterizadas por déficits del factor VIII (FVIII) y del factor IX (FIX) , respectivamente. La terapia de reemplazo es el tratamiento tradicional para la hemofilia A y B, e implica la administración intravenosa de FVIII o FIX, bien preparado a partir de plasma humano o bien como proteínas recombinantes. En muchos casos, sin embargo, los pacientes desarrollan anticuerpos (también conocidos como inhibidores) contra las proteínas infundidas, que reducen o anulan la eficacia 35 del tratamiento. El FVIIa recombinante (Novoseven®) se ha aprobado para el tratamiento de pacientes con hemofilia A o B que tienen inhibidores contra FVIII o FIX, y también se usa para detener episodios hemorrágicos o prevenir la hemorragia asociada con el traumatismo y/o la cirugía. El FVIIa recombinante también se ha aprobado para el tratamiento de pacientes con déficit congénito de FVII, y en pacientes no hemofílicos, se está utilizando cada vez más en usos no contemplados, tales como el tratamiento de la hemorragia asociada con otros trastornos 40 hemorrágicos congénitos o adquiridos, traumatismo y cirugía.

El uso de FVIIa recombinante para promover la formación de coágulos subraya su creciente importancia como un agente terapéutico. La terapia con FVIIa deja sin satisfacer necesidades médicas significativas. Por ejemplo, basándose en los datos de ensayo clínico, se requiere un promedio de 3 dosis de FVIIa durante un periodo de 45 tiempo de 6 horas o más para tratar episodios de hemorragia aguda en pacientes con hemofilia. Se necesitan variantes más eficaces de FVIIa para reducir estos requisitos. Por lo tanto, entre los objetos del presente documento, un objeto es proporcionar polipéptidos de FVII modificados que se diseñan para que tengan propiedades terapéuticas mejoradas.

El documento WO 2004/083661 proporciona variantes de FVII o FVIIa que comprenden al menos una modificación de aminoácido en la posición 196, 237 o 341 en relación con hFVII o hFVIIa. Las variantes muestran una actividad de coagulación aumentada, es decir tiempo de coagulación reducido, en comparación con rhFVIIa.

El documento WO 2004/111242 proporciona variantes de dominio Gla del Factor VII humano o del Factor VIIa 55 humano, que comprenden 1-15 modificaciones de aminoácidos en relación con el Factor VII humano o Factor VIIa humano, en las que se ha introducido un resto de aminoácido hidrófobo por sustitución en la posición 34, o que tienen una sustitución de aminoácido en la posición 36, o que tienen sustituciones de aminoácidos en las posiciones 10 y 32 y al menos una sustitución de aminoácido adicional en una posición seleccionada de 74, 77 y 116.

Sumario

En una primera realización la invención proporciona un polipéptido de factor VII (FVII) modificado, que comprende: un dominio Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo para efectuar la unión fosfolipídica, mediante la cual el polipéptido de FVII modificado muestra afinidad o unión con fosfolípidos aumentada en comparación con un 65 polipéptido FVII no modificado que no contiene el dominio Gla heterólogo en el que: la parte suficiente contiene 30 o más aminoácidos contiguos del dominio Gla heterólogo, y el dominio Gla heterólogo se selecciona de entre un dominio Gla en el Factor IX (FIX) , Factor X (FX) , protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína específica de detención del crecimiento 6 (Gas6) y proteína Z; y una o más modificaciones de aminoácidos adicionales que aumentan la resistencia a antitrombina III (AT-III) , aumentan la afinidad por el factor tisular (FT) , aumentan la actividad intrínseca, aumentan la actividad catalítica o coagulante dependiente de FT, aumentan la 5 actividad coagulante, alteran la formación del polipéptido para alterar la cimogenicidad, aumentan la actividad catalítica o coagulante desplazando el equilibrio entre conformaciones de FVIIa altamente activas y menos activas a favor de las conformaciones altamente activas, aumenta la resistencia a proteasas, reducen la glucosilación, aumentan la glucosilación, reducen la inmunogenicidad, aumentan la estabilidad y/o facilitan enlace de grupos químicos. 10

En una realización adicional la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de FVII modificado , un vector recombinante de dicho nucleótido y una célula que comprende dicho vector.

En una realización adicional la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una concentración terapéuticamente eficaz o cantidad de dicho polipéptido FVII modificado, molécula de ácido nucleico, vector o célula en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización adicional la invención proporciona dicho polipéptido de FVII modificado para su uso en el 20 tratamiento de una enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII o un procoagulante.

En una realización adicional la invención proporciona el uso de dicha composición farmacéutica en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII o un procoagulante. 25

En el presente documento se proporcionan polipéptidos del Factor VII (FVII) modificados. En particular, en el presente documento se proporcionan polipéptidos de FVII modificados que muestran actividades procoagulantes. Los polipéptidos de FVII se modifican en su secuencia primaria en comparación con un polipéptido de FVII no modificado, y pueden incluir inserciones, deleciones y reemplazos de aminoácidos. Los polipéptidos de FVII 30 modificados proporcionados en el presente documento incluyen polipéptidos de FVII que muestran resistencia aumentada a los efectos inhibidores del inhibidor de la ruta del factor tisular (IRFT) , resistencia aumentada a los efectos inhibidores de antitrombina III (AT-III) , reducción de la unión de Zn2+, aumento de las propiedades farmacocinéticas, tales como semivida aumentada, actividad catalítica aumenta en presencia y/o ausencia de FT y/o unión aumentada a plaquetas activadas. Los polipéptidos de FVII modificados pueden contener cualquier 35 combinación de modificaciones proporcionadas en el presente documento, por las que una o más actividades o propiedades del polipéptido están alteradas en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Típicamente el polipéptido de FVII modificado... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido del factor VII (FVII) modificado, que comprende:

un domino Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo para efectuar unión con fosfolípidos, por lo que el 5 polipéptido de FVII modificado muestra afinidad o unión con fosfolípidos aumentada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado que no contiene el dominio Gla heterólogo, donde:

la parte suficiente contiene 30 o más aminoácidos contiguos del dominio Gla heterólogo; y el dominio Gla heterólogo se selecciona de entre un dominio Gla en el factor IX (FIX) , Factor X (FX) , protrombina, proteína 10 C, proteína S, osteocalcina, proteína específica de detención del Crecimiento 6 (Gas6) y proteína Z; y

una o más modificaciones de aminoácidos adicionales que aumentan la resistencia a antitrombina III (AT-III) , aumentan la afinidad por el factor tisular (FT) , aumentan la actividad intrínseca, aumentan la actividad catalítica o coagulante dependiente de FT, aumentan la actividad coagulante, alteran la conformación del polipéptido para 15 alterar la zimogenicidad, aumentan la actividad catalítica o coagulante desplazando el equilibrio entre conformaciones de FVIIa altamente activo y menos activo a favor de las conformaciones altamente activas, aumentan la resistencia a proteasas, reducen la glucosilación, aumentan la glucosilación, reducen la inmunogenicidad, aumentan la estabilidad y/o facilitan el enlace de grupos químicos.

2. El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 1, donde el dominio Gla heterólogo tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEC ID Nº.

11. 115, 117 y 118, o la parte suficiente de la misma.

3. El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 1 o reivindicación 2, donde todo el dominio Gla de FVII nativo se retira y se reemplaza con el dominio Gla heterólogo. 25

4. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el dominio Gla heterólogo se selecciona de entre un dominio Gla en el Factor IX (FIX) , Factor X (FX) , protrombina, proteína C y proteína S.

5. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la modificación o las 30 modificaciones adicionales aumentan la resistencia al inhibidor de la ruta del factor tisular (IRFT) en comparación con un polipéptido de FVII no modificado.

6. El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 5, donde la modificación o las modificaciones adicionales son una o más modificaciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas de entre D196, K197, K199, G237, 35 T239, R290 y K341 en un polipéptido de FVII que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 o en restos correspondientes en un polipéptido de FVII, donde la modificación o las modificaciones adicionales confieren resistencia a IRFT aumentada.

7. El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 6, donde la o las modificaciones de aminoácidos se 40 seleccionan de entre D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196M, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, K341E, K341R, K341N, K341M, K341D, K341Q, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA y 45 K197I198insS.

8. El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 7, donde la o las modificaciones de aminoácidos se seleccionan de entre D196R/R290E, D196K/R290E, D196R/R290D, D196R/ K197E/K199E, D196K/K197E/K199E, D196R/K197E/ K199E/R290E, D196R/ K197M/ K199E y D196R/ K197M/K199E/R290E. 50

9. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende una o más modificaciones de aminoácidos adicionales en las posiciones Q176, M298 o E296 en un polipéptido de FVII que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 o en restos correspondientes en un polipéptido de FVII. 55

10. El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 9, donde las modificaciones de aminoácidos se seleccionan de entre Q176A, M298Q, E296V y E296A.

11. El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 9 o reivindicación 10, que comprende M298Q/ 60 A1Y44delinsYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQY.

12. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende una o más modificaciones de aminoácidos adicionales seleccionadas de entre S279CN302C, L280C/N301C, V281C/V302C, S282C/V299C, inserción de una tirosina en la posición 4, F4S, F4T, P10Q, P10E, P10D, P10N, Q21N, R28F, R28E, 65 I30C, 130D, I30E, K32D, K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32C, K32A, K32S, D33C, D33F, D33E, D33K, A34C,

A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, T37C, T37D, T37E, K38C, K38E, K38T, K38D, K38L, K38G, K38A, K38S, K38N, K38H, L39E, L39Q, L39H, W41N, W41C, W41E, W41D, I42R, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42K, S43Q, S43N, Y44K, Y44C, Y44D, Y44E, S45C, S45D, S45E, D46C, A51N, S53N, G58N, G59S, G59T, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, L65N, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, E82S, E82T, T83K, N95S, N95T, G97S, G97T, Y101N, 5 D104N, T106N, K109N, E116D, G117N, G124N, S126N, T128N, L141C, L141D, L141E, E142D, E142C, K143C, K143D, K143E, R144E, R144C, R144D, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, K157V, K157L, K157I, K157M, K157F, K157W, K157P, K157G, K157S, K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G, V158S, V158T, V158C, V158Y, V158N, V158E, V158R, V158K, 10 V158H, V158D, V158Q, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, Q250C, V253N, E265N, T267N, E270N, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, R277N, F278S, F278A, F278N, F278Q, F278G, L280N, L288K, L288C, L288D, D289C, D289K, L288E, R290C, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R290D, R290E, G291E, G291D, G291C, G291N, G291K, 15 A292C, A292K, A292D, A292E, T293K, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, P303S, P303T, R304Y, R304F, R304L, R304M, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L305P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, 20 L305D, L305Q, M306D, M306N, D309S, D309T, Q312N, Q313K, Q313D, Q313E, S314A, S314V, S314I, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, R315K, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, R315C, R315D, R315E, K316D, K316C, K316E, V317C, V317K, V317D, V317E, G318N, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W, N322C, G331N, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, D334G, 25 D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, K341E, K341Q, K341G, K341T, K341A, K341S, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, F374P, F374A, F374V, F374I, 30 F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q, V376N, R379N, L390C, L390K, L390D, L390E, M391D, M391C, M391K, M391N, M391E, R392C, R392D, R392E, S393D, S393C, S393K, S393E, E394K, P395K, E394C, P395D, P395C, P395E, R396K, R396C, R396D, R396E, P397D, P397K, P397C, P397E, G398K, G398C, G398D, G398E, V399C, V399D, V399K, V399E, L400K, L401K, L401C, L401D, L401E, R402D, R402C, R402K, R402E, A403K, A403C, A403D, A403E, P404E, P404D, 35 P404C, P404K, F405K, P406C, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/I42T, I42N/ Y44S, I42N/ Y44T, Y44N/ D46S, Y44N/ D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, K143N/N145S, K143N/N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E142S, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, 40 S147N/P149S, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/K316S, S314N/K316T, Q313N/R315S, Q313N/R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/D343S, K341N/D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/R392S, L390N/R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, 45 S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397NN399S, P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S y P404N/P406T.

13. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende la sustitución de las posicione.

30. 322.

30. 322.

30. 312 .

30. 312 con los aminoácidos correspondientes de tripsina, trombina o FX, o sustitución de las posicione.

31. 329.

31. 322 .

23. 329 con los aminoácidos correspondientes de tripsina.

14. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde el polipéptido de FVII no 55 modificado tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3.

15. El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 14 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 247.

16. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-15 que es un polipéptido activo o uno maduro.

17. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, donde solamente se modifica la secuencia primaria. 65

18. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, que comprende además una modificación química o una modificación postraduccional.

19. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de la reivindicación 18, donde el polipéptido de FVII está glucosilado, carboxilado, hidroxilado, sulfatado, fosforilado, albuminado o conjugado con un resto de polietilenglicol 5 (PEG) .

20. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-19 que es un polipéptido monocatenario o es un polipéptido bicatenario.

21. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-20 que está activo o activado.

22. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-21, donde la actividad de coagulación aumenta.

23. Una molécula de ácido nucleico, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-22.

24. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 23.

25. El vector de la reivindicación 24, donde el vector es un vector procariota, vector viral o un vector eucariota.

26. El vector de la reivindicación 24 o reivindicación 25, donde el vector es un vector de mamífero.

27. El vector de la reivindicación 25, donde el vector es un vector viral seleccionado de entre un adenovirus, un virus 25 adenoasociado, un retrovirus, un virus del herpes, un lentivirus, un poxvirus y un citomegalovirus.

28. Una célula, que comprende el vector de cualquiera de las reivindicacione.

2. 27.

29. La célula de la reivindicación 28 que es una célula eucariota. 30

30. La célula de la reivindicación 29, donde la célula eucariota es una célula de mamífero.

31. La célula de la reivindicación 30, donde la célula de mamífero se selecciona de entre células de riñón de cría de hámster (BHK-21) o células 293 o células CHO. 35

32. La célula de la reivindicación 28 que es una célula de levadura.

33. La célula de la reivindicación 32 que es una célula de Pichia sp.

34. La célula de cualquiera de las reivindicacione.

2. 33, donde la célula expresa el polipéptido de FVII modificado.

35. Un polipéptido de FVII modificado que se produce por la célula de cualquiera de las reivindicacione.

2. 34.

36. Una composición farmacéutica, que comprende una concentración o cantidad terapéuticamente eficaz de un 45 polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-22 y 35, o una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 23 o un vector de cualquiera de las reivindicacione.

2. 27 o una célula de cualquiera de las reivindicacione.

2. 34, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

37. La composición farmacéutica de la reivindicación 36 que se formula para administración local, sistémica o tópica. 50

38. La composición farmacéutica de la reivindicación 36 o reivindicación 37 que se formula para administración oral, nasal, pulmonar, bucal, transdérmica, subcutánea, intraduodenal, entérica, parenteral, intravenosa o intramuscular.

39. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicacione.

3. 38 que se formula para liberación 55 controlada.

40. Un polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-22 y 35 para uso en el tratamiento de una enfermedad o afección que se trata mediante la administración de FVII o un procoagulante.

41. Uso de una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicacione.

3. 39 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII o un procoagulante.

42. Un polipéptido de FVII modificado para uso de acuerdo con la reivindicación 40, o el uso de la reivindicación 41, 65 donde la enfermedad o afección se trata por administración de un zimógeno o forma activa de FVII.

43. Un polipéptido de FVII modificado para uso de acuerdo con la reivindicación 40 o reivindicación 42, o el uso de la reivindicación 41 o reivindicación 42, donde la enfermedad o afección para tratar se selecciona de entre trastornos de coagulación sanguínea, trastornos hematológicos, trastornos hemorrágicos, hemofilias, deficiencia del factor VII, trastornos de sangrado, sangrado quirúrgico y sangrado resultante de traumatismo o se debe a una complicación de sangrado debido a cirugía o traumatismo. 5

44. Un polipéptido de FVII modificado para uso de acuerdo con la reivindicación 43, o el uso de la reivindicación 43, donde la hemofilia es hemofilia A o hemofilia B o hemofilia C o es adquirida.