ESCISIÓN DE VEGF Y RECEPTOR DE VEGF MEDIANTE MT-SP1 DE TIPO SILVESTRE Y MUTANTE.

Escisión de VEGF y receptor de VEGF mediante MT-SP1 de tipo silvestre y mutante Antecedentes de la invención El proceso de angiogénesis es central a la patología de afecciones que incluyen malignidad, retinopatía diabética y degeneración macular. El hecho de que el cáncer es dependiente de angiogénesis se ha apoyado recientemente por experimentación en la que la inhibición sorprendente de crecimiento de tumor se puede conseguir no mediante tratamiento directo del tumor, sino en lugar de ello mediante inhibición selectiva del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF). VEGF es un mitógeno específico de células endoteliales producidas normalmente durante la embriogénesis y la vida adulta. VEGF funciona como un mediador significativo de la angiogénesis en una diversidad de procesos normales y patológicos, incluyendo desarrollo tumoral. La vascularización tumoral es un proceso vital para la progresión de un tumor hasta una fase a partir de la cual el mismo puede metastatizar. Se han identificado tres receptores de VEGF afines de afinidad elevada (VEGFR): VEGFR-1/Flt-1, VEGFR-2/KDR y VEGFR-3/Flt-4. Los VEGFR son tirosina quinasas receptoras de superficie celular que funcionan como moléculas de señalización durante el desarrollo vascular. Una observación común en estudios preclínicos de agentes anti-angiogénicos que se dirigen a VEGF ha sido la inhibición potente y de amplio espectro de muy diversos tipos tumorales (tejido sólido y hematológico), que es consistente con la dependencia generalizada del cáncer de la angiogénesis independientemente del tejido de origen. Inyecciones i.v. únicas de adenovirus que expresan Flk1 y Flt1 soluble transducen el hígado, expresan niveles elevados en plasma y secuestran VEGF de sus receptores nativos en las células endoteliales. Estos receptores de VEGF circulantes producen inhibición sistémica de la angiogénesis en ensayos de microbolsa corneal y más importante producen inhibición marcada y de amplio espectro de angiogénesis tumoral y crecimiento tumoral en tumores de pulmón, próstata, colon, cerebro y páncreas establecidos en modelos subcutáneo, ortotópico y transgénico. Véase, por ejemplo, Kuo et al. 2001 PNAS 98: 4605-10. Recientemente, la eficacia de terapia antiangiogénica se ha demostrado en un ensayo de fase III aleatorizado usando el anti-VEGF monoclonal AVASTIN (Genentech) para tratar pacientes con cáncer de colon metastásico, proporcionando de ese modo prueba del principio de esta estrategia de tratamiento en neoplasia humana. Sumario de la invención ES 2 374 560 T3 La naturaleza ha diseñado los cientos de proteasas en el genoma humano para definición exquisita de forma que la especificidad, inhibición e hidrólisis se adaptan perfectamente al nicho fisiológico. Aunque se ha demostrado que algunas proteasas están reguladas negativamente en el cáncer, hasta la fecha no se conocen proteasas naturales que funcionen para defender al organismo de tumorogénesis. Sin embargo, existen aplicaciones claras de proteasas programadas para hidrolizar proteínas necesarias para el crecimiento del cáncer. Esta invención combina técnicas de ingeniería de proteínas basada en estructura con ensayos de biblioteca combinatoria sintética de exploración posicional (PSSCL) para proporcionar serina proteasas novedosas con especificidad que, colectivamente, coinciden con el tronco de VEGF-R2 sobre una región extendida. La creación de perfiles mediante PSSCL es una tecnología patentada que genera un perfil de especificidad de sustrato completo o identificación genética de cada proteasa sometida a ingeniería genética en un ensayo único. Con esta tecnología, ahora es posible identificar proteasas terapéuticamente pertinentes que tienen especificidad potenciada hacia sustratos diana y poca o ninguna actividad hacia sustratos de tipo silvestre. En el proceso de diseño, se producen cientos de proteasas con perfiles de especificidad alterados. La tecnología ofrece una oportunidad sin precedentes de estudiar las características estructurales de especificidad. Con una exploración de proteasas con PSSCL, se pueden identificar los determinantes de selectividad y eficacia catalítica de serina proteasa. Los mismos ofrecen no sólo una oportunidad de descubrir reglas fundamentales con respecto a la función de las serina proteasas, sino también información adicional para el diseño de moléculas terapéuticamente pertinentes. La presente invención proporciona composiciones y métodos para el uso de proteasas que escinden proteínas que se conoce que están implicadas en enfermedad. En particular, se proporcionan polipéptidos de serina proteasa-1 (MT-SP1) de tipo silvestre y de tipo membrana de muteína que escinden VEGF o receptor de VEGF, que se conoce que está implicado en la angiogénesis. Las proteínas modificadas resultantes se proporcionan para uso como agentes para terapia in vivo de cánceres y otras patologías relacionadas con angiogénesis, incluyendo pero sin limitación, degeneración macular, inflamación y diabetes. La invención también proporciona métodos para la modificación de proteasas para alterar su especificidad de secuencia sustrato, de forma que la proteasa modificada escinde específicamente una proteína de VEGF o receptor de VEGF. La escisión de VEGF o VEGFR se proporciona para el tratamiento de una amplia diversidad de cánceres en los que el tratamiento da como resultado la reducción o inhibición de vascularización necesaria para el crecimiento tumoral continuado. En una realización de la invención, esta proteasa modificada es una serina proteasa. En otra realización de la invención, esta proteasa modificada es una muteína de MT-SP1. Una realización de la invención implica generar una biblioteca de secuencias de proteasa para usarse para seleccionar proteasas modificadas que escinden VEGF o un VEGFR en una secuencia sustrato deseada. En un 2   ES 2 374 560 T3 aspecto de esta realización, cada miembro de la biblioteca es un armazón de proteasa con al menos una mutación realizada a cada miembro diferente de la biblioteca de proteasa. El resto del armazón de proteasa tiene la misma secuencia o una secuencia similar a la proteasa MT-SP1 de tipo silvestre. La actividad de escisión de cada miembro de la biblioteca de proteasa se mide usando la secuencia sustrato deseada a partir de la proteína diana de VEGF o VEGFR. Como resultado, se detectan proteasas con la actividad de escisión más elevada con respecto a la secuencia sustrato deseada. En otro aspecto de esta realización, el número de mutaciones realizadas en el armazón de proteasa es 1, 2-5 (por ejemplo, 2, 3, 4 ó 5), 5-10 (por ejemplo 5, 6, 7, 8, 9 ó 10) o 10-20 (por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20). En una realización preferida, la mutación o mutaciones confieren especificidad de sustrato aumentada. En una realización específica, la mutación o mutaciones se posicionan en el armazón en al menos uno de los sitios S1, S2, S3 y S4. En determinados aspectos de esta realización, la actividad de la proteasa de muteína está aumentada en al menos 10 veces, 100 veces o 1000 veces con respecto a la actividad de la proteasa de tipo silvestre. En aspectos relacionados, el aumento es en especificidad de sustrato. En otra realización de la invención, los miembros de una biblioteca están formados de secuencias de aminoácido aleatorizadas y se mide la selectividad de escisión de cada miembro de la biblioteca por la proteasa. Este tipo de biblioteca se denomina en el presente documento una biblioteca de sustrato. Se detectan las secuencias sustrato que se escinden de forma más eficaz por la proteasa. En aspectos específicos de esta realización, la secuencia sustrato en una biblioteca de sustrato tiene 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 aminoácidos de largo. En otra realización de la invención, los miembros de la biblioteca de sustrato están formados por secuencias de aminoácido aleatorizadas y se mide la selectividad de escisión de cada miembro de la biblioteca mediante la proteasa. Se detectan las secuencias sustrato que se escinden más selectivamente por la proteasa. En aspectos específicos de esta realización, la secuencia sustrato en la biblioteca de sustrato tiene 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19 ó 20 aminoácidos de largo. En una realización de este ejemplo, la especificidad se mide observando cuántas secuencias sustrato diferentes escinde la proteasa a una actividad determinada. Las proteasas que escinden menos secuencias sustrato a una actividad determinada tienen mayor especificidad que aquellas que escinden más secuencias sustrato. En un aspecto de esta realización, la secuencia sustrato es una parte de una proteína diana de VEGF o VEGFR. En una realización específica los péptidos de biblioteca de sustrato incluyen los restos... [Seguir leyendo]

1. Uso de una composición para formular un medicamento para escindir factor del crecimiento endotelial vascular (VEGF) o receptor del VEGF (VEGFR), en el que: la composición comprende una serina proteasa 1 de tipo de membrana de muteína (MT-SP1) que comprende al menos una mutación en una proteasa MT-SP1 de armazón; la proteasa MT-SP1 de armazón tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 95% a la secuencia de aminoácidos de MT-SP1 de tipo silvestre expuesta en SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 2 o una parte catalíticamente activa de la misma; la muteína de MT-SP1 tiene al menos una mutación en una o más posiciones seleccionadas entre 41, 58, 59, 60b, 60c, 61, 62, 63, 97, 98, 100, 146, 151, 169, 170, 172, 173, 175, 176, 177, 178, 179, 181 y 224, en la que la numeración se basa en quimotripsina; la mutación aumenta la actividad y/o modifica la especificidad diana de la proteasa muteína de MT-SP1 en comparación con la proteasa MT-SP1 de tipo silvestre; y la proteasa muteína de MT-SP1 escinde VEGF o VEGFR. 2. El uso de la reivindicación 1, en el que la proteasa muteína de MT-SP1 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº o SEC ID Nº: 2. 3. El uso de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que los restos mutados modifican la especificidad diana. 4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la mutación se selecciona entre D60bl, D60bF, D60bR, D60bA, R60cl, R60cF, R60cD, R60cA, R60cW, F97N, F97D, F97E, F97A, F97W, F97R, Y146F, Y146N, Y146D, Y146E, Y146A, Y146W, Y146R, L172N, L172D, L172E, L172A, L172V, L172F, L172R, Q175D, Q175E, Q175A, Q175V, Q175F, Q175R, K224A, K224F, K224V y K224D. 5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la muteína de MT-SP1 contiene una mutación adicional que se selecciona entre mutaciones que corresponden a D60bl, D60bF, D60bR, D60bA, R60cl, R60cF, R60cD, R60cA, R60cW, F97N, F97D, F97E, F97A, F97W, F97R, F99Y, F99W, F99N, F99D, F99E, F99A, F99V, F99R, Y146F, Y146N, Y146D, Y146E, Y146A, Y146W, Y146R, L172N, L172D, L172E, L172A, L172V, L172F, L172R, Q175D, Q175E, Q175A, Q175V, Q175F, Q175R, M180E, M180Y, M180R, M180A, Q192A, Q192V, Q192D, Q192R, Q192F, W215F, W215Y, W215I, W215D, W215R, D217A, D217V, D217F, D217E, D217R, K224A, K224F, K224V y K224D. 6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la muteína de MT-SP1 contiene mutaciones seleccionadas entre las mutaciones que corresponden a L172D/Q175D, F99V/L172D, F99V/L172D/Q175D, F99V/K224F, F99V/M180E, F99V/Y146D, Y146D/K224F, Y146D/M180E, Y146D/L172D/Q175D, F99V/Y146D/L172D/Q175D, F991/L172D/Q175D, F99L/L172D/Q175D, F99T/L172D/Q175D, F99A/L172D/Q175D, F99I/K224F, F99L/K224F, F99T/K224F, F99V/Y146D/K224F, F99I/Y146D/K224F, F99UY146D/K224F y F99T/Y146D/K224F. 7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la escisión de VEGF o VEGFR inhibe la angiogénesis o abroga la proliferación celular. 8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la escisión de VEGF o VEGFR inhibe la angiogénesis específica de tumor. 9. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la escisión de VEGF o VEGFR logra el tratamiento de una patología relacionada con angiogénesis en un paciente. 10. El uso de la reivindicación 9, en el que la patología se selecciona entre degeneración macular, cáncer, inflamación y diabetes. 11. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que: la muteína de MT-SP1 escinde un sitio de reconocimiento de sustrato de P4-P3-P2-P1 en el VEGFR diana; y el sitio P4- P3-P2-P1 comprende una secuencia de cuatro aminoácidos encontrada en un VEGFR. 12. El uso de la reivindicación 11, en el que la muteína de MT-SP1 es más selectiva de un sitio de reconocimiento de sustrato de VEGFR en comparación con el sitio de reconocimiento de sustrato de MT-SP1 de tipo silvestre. 13. El uso de la reivindicación 11, en el que el sitio de reconocimiento de sustrato de P4-P3-P2-P1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre RRVR, KVGR, RVRK, RKTK, KTKK y KTTR. 14. El uso de la reivindicación 11, en el que el sitio de reconocimiento de sustrato de P4-P3-P2-P1 comprende una secuencia de aminoácidos de RRVR.   ES 2 374 560 T3 15. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 5-14, en el que la muteína de MT-SP contiene una mutación seleccionada entre L172D, Y146F, N175D, D217F, F99V y K224F. 16. El uso de la reivindicación 15, en el que la muteína de MT-SP1 contiene mutaciones K224F y F99V. 17. El uso de la reivindicación 12, en el que VEGFR es VEGF-R2/flk-1/KDR. 18. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que la especificidad diana de la proteasa muteína de MT- SP1 está aumentada en al menos 2 veces en comparación con la proteasa MT-SP1 de tipo silvestre. 19. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 10-18, en el que la patología es cáncer. 20. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en el que la composición comprende además un agente anticáncer. 21. Una proteasa muteína de MT-SP1, que comprende al menos una mutación en un armazón, en la que: la proteasa MT-SP1 de armazón tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 95% a la secuencia de aminoácidos de MT-SP1 de tipo silvestre expuesta en SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 2 o una parte catalíticamente activa de la misma; la muteína de MT-SP1 tiene al menos una mutación en una o más posiciones seleccionadas entre 41, 58, 59, 60b, 60c, 61, 62, 63, 97, 98, 100, 146, 151, 169, 170, 172, 173, 175, 176, 177, 178, 179, 181 y 224, en la que la numeración se basa en quimotripsina; la mutación modifica la especificidad diana y/o aumenta la actividad de la proteasa muteína de MT-SP1 en comparación con la proteasa MT-SP1 de tipo silvestre; y la proteasa muteína de MT-SP1 escinde VEGF o un VEGFR. 22. La proteasa MT-SP1 mutante de la reivindicación 21, en la que el polipéptido de armazón de MT-SP1 se expone en SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 2. 23. La proteasa muteína de MT-SP1 de la reivindicación 21 o reivindicación 22, en la que una mutación se selecciona entre D60bl, D60bF, D60bR, D60bA, R60cl, R60cF, R60cD, R60cA, R60cW, F97N, F97D, F97E, F97A, F97W, F97R, Y146F, Y146N, Y146D, Y146E, Y146A, Y146W, Y146R, L172N, L172D, L172E, L172A, L172V, L172F, L172R, Q175D, Q175E, Q175A, Q175V, Q175F, Q175R, K224A, K224F, K224V y K224D. 24. La proteasa muteína de MT-SP1 de cualquiera de las reivindicaciones 21-23, en la que una mutación adicional se selecciona entre las mutaciones que corresponden a D60bl, D60bF, D60bR, D60bA, R60cl, R60cF, R60cD, R60cA, R60cW, F97N, F97D, F97E, F97A, F97W, F97R, F99Y, F99W, F99N, F99D, F99E, F99A, F99V, F99R, Y146F, Y146N, Y146D, Y146E, Y146A, Y146W, Y146R, L172N, L172D, L172E, L172A, L172V, L172F, L172R, Q175D, Q175E, Q175A, Q175V, Q175F, Q175R, M180E, M180Y, M180R, M180A, Q192A, Q192V, Q192D, Q192R, Q192F, W215F, W215Y, W215I, W215D, W215R, D217A, D217V, D217F, D217E, D217R, K224A, K224F, K224V y K224D. 25. La proteasa muteína de MT-SP1 de cualquiera de las reivindicaciones 21-24, que comprende mutaciones seleccionadas entre las mutaciones que corresponden a L172D/Q175D, F99V/L172D, F99V/L172D/Q175D, F99V/K224F, F99V/M180E, F99V/Y146D, Y146D/K224F, Y146D/M180E, Y146D/L172D/Q175D, F99V/Y146D/L172D/Q175D, F99I/L172D/Q175D, F99L/L172D/Q175D, F99T/L172D/Q175D, F99A/L172D/Q175D, F99I/K224F, F99L/K224F, F99T/K224F, F99V/Y146D/K224F, F991/Y146D/K224F, F99L/Y146D/K224F y F99T/Y146D/K224F. 26. La proteasa muteína de MT-SP1 de la reivindicación 24, que comprende mutaciones seleccionadas entre mutaciones que corresponden a L172D, Y146F, Q175D, D217F, F99V y K224F, en la que la numeración se basa en quimotripsina. 27. La proteasa muteína de MT-SP1 de la reivindicación 26, que comprende mutaciones que corresponden a F99V/K224F o Y146D/K224F. 28. Una composición, que comprende una proteasa MT-SP1 mutante de cualquiera de las reivindicaciones 21-27. 29. La composición de la reivindicación 28 que es una composición farmacéutica. 41   ES 2 374 560 T3 42   ES 2 374 560 T3 43   ES 2 374 560 T3 44   ES 2 374 560 T3   ES 2 374 560 T3 46   ES 2 374 560 T3 47   ES 2 374 560 T3 48   ES 2 374 560 T3 49   ES 2 374 560 T3   ES 2 374 560 T3 51   ES 2 374 560 T3 52   ES 2 374 560 T3 53   ES 2 374 560 T3 54   ES 2 374 560 T3   ES 2 374 560 T3 56   ES 2 374 560 T3 57   ES 2 374 560 T3 58   ES 2 374 560 T3 59