Proteasas modificadas que inhiben la activación del complemento.

Una proteasa modificada que no pertenece al complemento, que comprende modificaciones en uno cualquiera o más aminoácidos de una proteasa armazón,

en la que: 5 el resto o los restos de aminoácidos modificados aumentan una o ambas de la especificidad por un sustrato diana o la actividad hacia un sustrato diana, en la que el sustrato diana es una proteína del complemento; la proteasa armazón es una proteasa MT-SP1, variantes alélicas, isoformas o una parte catalíticamente activa de la misma; y la proteasa modificada que no pertenece al complemento comprende:

a) al menos dos o más modificaciones en la proteasa armazón, en la que una modificación está en la posición 146 y la segunda modificación está en la posición 224, en base a la numeración de la quimotripsina, a condición de que:

(i) cuando la proteasa solo incluye dos modificaciones, la proteasa no incluya Y146D ni K224F como las dos modificaciones; y

(ii) cuando la proteasa contiene tres modificaciones, la proteasa no incluya F99V o I o L o T con Y146D y K224F; o

b) una o más modificaciones en la proteasa armazón seleccionadas entre una cualquiera o más de D96A, D96V, D96F, D96S, D96T, F99S, F99G, Q174H, Q174A, Q174V, Q174F, Q174R, Q174K, Q174L, Q174Y, Q192L, Q192I, Q192E, Q192K, Q192Y, D217Q, D217N, D217H, Q221aD, en base a la numeración de la quimotripsina; o

c) una o más modificaciones en la proteasa armazón seleccionadas entre I41T, I41A, 141L, 141F, 141D, 25 141E, G147E, G151L, Q221aL, Q221aE, Q175H, Q175L, Q175W, Q175Y, Q175K, K224L, K224R, K224N, K224T, K224Y y K224S, en base a la numeración de la quimotripsina.

Proteasas modificadas que inhiben la activación del complemento

Solicitudes relacionadas Se reivindican los derechos de prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos Nº de Serie 60/729.817, presentada el 21 de Octubre de 2005, titulada “PROTEASAS MODIFICADAS QUE INHIBEN LA ACTIVACIÓN DEL COMPLEMENTO”, de Edwin Madison.

Esta solicitud está relacionada con la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie (Expediente del Mandatario Nº 19049-003001/4903) , presentada el 20 de Octubre del 2006, titulada “PROTEASAS MODIFICADASQUE INHIBEN LA ACTIVACIÓN DEL COMPLEMENTO”, de Edwin Madison, Jack Nguyen, Sandra Waugh Ruggles y Christopher Thanos, que también reivindican prioridad con respecto a la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº de Serie 60/729.817.

La presente solicitud está relacionada con la solicitud de Estados Unidos Nº de Serie 10/677.977, presentada el 2 de Octubre de 2003, titulada Métodos de Generación y Selección de Proteasas con Especificidad Modificada; con la solicitud de Estados Unidos Nº de Serie 11/104.110, presentada el 12 de Abril de 2005, titulada Escisión de VEGF y del Receptor de VEGF por MTSP-1 de Tipo Silvestre y Mutante; y con la solicitud de Estados Unidos Nº de Serie 11/104.111, presentada el 12 de Abril de 2005, titulada Escisión de VEGFR y del Receptor de VEGF por Proteasas de Tipo Silvestre y Mutantes.

Campo de la invención Se proporcionan medios para modular el sistema del complemento. En particular, se describen compuestos que inhiben la activación del complemento y se describen compuestos que promueven la actividad del complemento. Los compuestos son agentes terapéuticos debido a sus efectos sobre el sistema del complemento. Por tanto, los compuestos que inhiben la activación del complemento pueden usarse para el tratamiento de trastornos isquémicos y de reperfusión, incluyendo infarto de miocardio e ictus, septicemia, enfermedades autoinmunitarias, trastornos inflamatorios y enfermedades con un componente inflamatorio, incluyendo la Enfermedad de Alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos.

Antecedentes El sistema del complemento (C) es parte del sistema inmunitario y desempeña una función en la eliminación de patógenos invasores y en el inicio de la respuesta inflamatoria. El sistema del complemento de seres humanos y de otros mamíferos implica más de 30 proteínas solubles y unidas a la membrana que participan en una secuencia de reacciones ordenada que da como resultado la activación del complemento. El sistema del complemento sanguíneo tiene una amplia serie de funciones asociadas con un amplio espectro de mecanismos de defensa del hospedador que incluyen acciones antimicrobianas y antivirales. Los productos derivados de la activación de los componentes C incluyen las moléculas de reconocimiento de elementos no propios C3b, C4b y C5b, así como las anafilatoxinas C3a, C4a y C5a que influyen sobre diversas respuestas inmunitarias celulares. Estas anafilatoxinas actúan como agentes proinflamatorios.

El sistema del complemento se compone de una serie de enzimas y proteínas no enzimáticas y receptores. La activación de complemento se produce por uno de tres modos primarios conocidos como la ruta "clásica", la ruta "alternativa" y la ruta de las "lectinas" (véase la FIGURA 1) . Estas rutas pueden diferenciarse por el proceso que inicia la activación del complemento. La ruta clásica se inicia mediante complejos anticuerpo-antígeno o formas agregadas de inmunoglobulinas; la ruta alternativa se inicia mediante el reconocimiento de estructuras sobre superficies microbianas y celulares; y la ruta de la lectina, que es una ruta independiente de anticuerpos, se inicia mediante la unión de la lectina de unión a manano (MBL, denominada también proteína de unión a manosa) a hidratos de carbono tales como los que se presentan en la superficie de las bacterias o virus. La activación de las cascadas da como resultado la producción de complejos implicados en la proteolisis o lisis celular y de péptidos implicados en la opsonización, anafilaxis y quimiotaxis.

La casada del complemento, que es un componente central de la respuesta inmunitaria de un animal, es una cascada irreversible. Numerosos cofactores proteicos regulan el proceso. La regulación inapropiada, típicamente la activación inapropiada, del proceso es un aspecto de, o puede ocurrir en, diversos trastornos que implican respuestas inflamatorias inapropiadas, tales como los observados en enfermedades inflamatorias agudas y crónicas. Estas enfermedades y trastornos incluyen enfermedades autoinmunitarias tales como artritis reumatoide y lupus, trastornos cardiacos y otras enfermedades inflamatorias tales como septicemia y lesión de isquemia-reperfusión.

Debido a la implicación de las rutas del complemento en una diversidad de enfermedades y afecciones, los componentes de las rutas del complemento son dianas para una intervención terapéutica, particularmente para la inhibición de la ruta. Los ejemplos de dichos agentes terapéuticos incluyen agentes terapéuticos de molécula

pequeña sintéticos y naturales, inhibidores de anticuerpos y formas solubles recombinantes de reguladores del complemento de membrana. Hay limitaciones en las estrategias para la preparación de dichos agentes terapéuticos. Las moléculas pequeñas tienen cortas semividas in vivo y necesitan infundirse de forma continua para mantener la inhibición del complemento, lo cual limita su papel, especialmente en enfermedades crónicas. Los anticuerpos terapéuticos dan como resultado una respuesta inmunitaria en un sujeto y, por tanto, pueden conducir a complicaciones en el tratamiento, particularmente en tratamientos diseñados para modular respuestas inmunitarias. Por lo tanto, existe una necesidad no satisfecha de agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades y trastornos mediados por el complemento en los que intervenga la activación del complemento. Estas incluyen enfermedades inflamatorias agudas y crónicas. Por consiguiente, entre los objetos del presente documento, existe un objeto para proporcionar dichos agentes terapéuticos para dirigir la activación de la cascada del complemento y para proporcionar agentes terapéuticos y métodos del tratamiento de enfermedades.

Sumario La invención proporciona:

(1) Una proteasa modificada que no pertenece al complemento, que comprende modificaciones en uno cualquiera o más aminoácidos de una proteasa armazón, en la que:

el resto o los restos de aminoácidos modificados aumentan una o ambas de la especificidad por un sustrato diana o la actividad hacia un sustrato diana, en la que el sustrato diana es una proteína del complemento; la proteasa armazón es una proteasa MT-SP1, variantes alélicas, isoformas o una parte catalíticamente activa de la misma; y la proteasa modificada que no pertenece al complemento comprende:

a) al menos dos o más modificaciones en la proteasa armazón, en la que una modificación está en la posición 146 y la segunda modificación está en la posición 224, en base a la numeración de la quimotripsina, a condición de que:

(i) cuando la proteasa solo incluye dos modificaciones, la proteasa no incluya Y146D ni K224F como las dos modificaciones; y

(ii) cuando la proteasa contiene tres modificaciones, la proteasa no incluya F99V o I o L o T con Y146D y K224F; o

b) una o más modificaciones en la proteasa armazón seleccionadas entre una cualquiera o más de D96A, D96V, D96F, D96S, D96T, F99S, F99G, Q174H, Q174A, Q174V, Q174F, Q174R, Q174K, Q174L, Q174Y, Q192L, Q192I, Q192E, Q192K, Q192Y, D217Q, D217N, D217H, Q221aD, en base a la numeración de la quimotripsina; o c) una o más modificaciones en la proteasa armazón seleccionadas entre I41T, I41A, 141L, 141F, 141D, 141E, G147E, G151L, Q221aL, Q221aE, Q175H, Q175L, Q175W, Q175Y, Q175K, K224L, K224R, K224N, K224T, K224Y y K224S, en base a la numeración de la quimotripsina.

(2) La proteasa modificada que no pertenece al complemento de (1) , en la que la proteasa MT-SP1 o una parte catalíticamente activa de la misma comprende una secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 2 o 10.

(3) La proteasa modificada que no pertenece al complemento de (1) , en la que:

la proteasa modificada que no pertenece al complemento se indica en a) ; y la proteasa modificada que no pertenece al complemento comprende una modificación en la posición 151, en base a la numeración de la quimotripsina.

(4) La proteasa modificada que no pertenece al complemento de (1) , en la que:

la proteasa modificada que no pertenece al complemento se indica en a) ; y la proteasa modificada que no pertenece al complemento comprende una modificación en la posición... [Seguir leyendo]

1. Una proteasa modificada que no pertenece al complemento, que comprende modificaciones en uno cualquiera o más aminoácidos de una proteasa armazón, en la que:

el resto o los restos de aminoácidos modificados aumentan una o ambas de la especificidad por un sustrato diana o la actividad hacia un sustrato diana, en la que el sustrato diana es una proteína del complemento; la proteasa armazón es una proteasa MT-SP1, variantes alélicas, isoformas o una parte catalíticamente activa de la misma; y la proteasa modificada que no pertenece al complemento comprende:

a) al menos dos o más modificaciones en la proteasa armazón, en la que una modificación está en la posición 146 y la segunda modificación está en la posición 224, en base a la numeración de la quimotripsina, a condición de que:

(i) cuando la proteasa solo incluye dos modificaciones, la proteasa no incluya Y146D ni K224F como las dos modificaciones; y

(ii) cuando la proteasa contiene tres modificaciones, la proteasa no incluya F99V o I o L o T con Y146D y K224F; o

b) una o más modificaciones en la proteasa armazón seleccionadas entre una cualquiera o más de D96A, D96V, D96F, D96S, D96T, F99S, F99G, Q174H, Q174A, Q174V, Q174F, Q174R, Q174K, Q174L, Q174Y, Q192L, Q192I, Q192E, Q192K, Q192Y, D217Q, D217N, D217H, Q221aD, en base a la numeración de la quimotripsina; o c) una o más modificaciones en la proteasa armazón seleccionadas entre I41T, I41A, 141L, 141F, 141D, 141E, G147E, G151L, Q221aL, Q221aE, Q175H, Q175L, Q175W, Q175Y, Q175K, K224L, K224R, K224N, K224T, K224Y y K224S, en base a la numeración de la quimotripsina.

2. La proteasa modificada que no pertenece al complemento de la reivindicación 1, en la que la proteasa MT-SP1 o una parte catalíticamente activa de la misma comprende una secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 2

o 10.

3. La proteasa modificada que no pertenece al complemento de la reivindicación 1, en la que:

la proteasa modificada que no pertenece al complemento se indica en a) ; y la proteasa modificada que no pertenece al complemento comprende una modificación en la posición 151, en base a la numeración de la quimotripsina.

4. La proteasa modificada que no pertenece al complemento de la reivindicación 1, en la que:

la proteasa modificada que no pertenece al complemento se indica en a) ; y la proteasa modificada que no pertenece al complemento comprende una modificación en la posición 41, en base a la numeración de la quimotripsina.

5. La proteasa modificada que no pertenece al complemento de la reivindicación 1, en la que:

la proteasa modificada que no pertenece al complemento se indica en a) ; y la modificación o modificaciones en una proteasa MT-SP1 o una parte catalíticamente activa de la misma se seleccionan entre Y146E/K224N, I41T/Y146E/Q175D/K224R, I41T/Y146D/K224F, I41T/Y146E/Q175D/K224N, 141T/Y146E/G151L/Q175D/K224L, Y146E/Q221aE/K224F, I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224R, 141T/Y146E/G151L/Q175D/K224N, Y146E/K224R, Y146E/Q175D/K224N, Y146D/K224R, I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224F, Y46E/Q75D/K224R, Y146E/K224L, Y146D/Q175D/K224R, Y146D/Q175L/K224L, Y146D/Q175W/K224L, Y146D/K224L, Y146E/Q221aE/K224R, Y146E/K224A, Y146D/Q175H/K224L, Y146D/Q175Y/K224L, Y146E/K224Y, Y146D/Q175F/K224L, Y46D/Q221aL/K224S, I41EA146D/K224L, Y146D/D217F/K224L, H143V/Y146D/K224F, Y146E/K224F, Y146A/K224F, Y146E/K224T, I41T/Y146E/K224L, 141F/Y146D/K224F, I41L/Y146D/K224F, I41T/Y146D/G151L/K224F, I41A/Y146D/K224F, I41E/Y146D/K224F, I41D/Y146D/K224L, I41D/Y146D/K224F, Y146N/K224F, I41T/Y146D/Q175D/K224F, Y146D/Q192A/K224F, I41T/Y146D/Q175D/K224L, I41T/Y146D/Q175D/K224R, I41T/Y146D/Q175D/K224N, I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224F, 141T/Y146D/G151L/Q175D/K224L, I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224R, I41T/Y146D/G151L/Q175D/K224N, I41T/Y146E/Q175D/K224F, I41T/Y146E/Q175D/K224L, 141T/Y146D/G151L/K224N, Y146D/Q175D/K224N, Y146D/G151L/K224N, Y146D/Q175R/K224N, Y146D/Q175K/K224N, Y146D/Q175H/K224N, I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224F, I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224F, I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224F, I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224F, I41T/Y146D/G151L/Q175K/K224N, I41T/Y146D/G151L/Q175R/K224N, I41T/Y146D/G151L/Q175H/K224N Y146D/K224N, I41T/Y146D/K224L, I41T/Y146E/G151L/Q175D/K224N, I41T/Y146D/K224N e I41T/Y146D/G151L/Q175Y/K224N, en base a la numeración de la quimotripsina.

6. La proteasa modificada que no pertenece al complemento de la reivindicación 5, en la que la proteasa modificada que no pertenece al complemento tiene una secuencia de aminoácidos indicada en una cualquiera de las SEC ID Nº.

55. 559.

56. 566.

57. 580.

58. 591.

59. 602, 604.

60. 613.

61. 620.

62. 634.

63. 645.

64. 656, 658 o 663

710.

7. La proteasa modificada que no pertenece al complemento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que:

la proteasa modificada que no pertenece al complemento se indica en b) o c) ; y la modificación o modificaciones en una proteasa MT-SP1 o una parte catalíticamente activa de la misma corresponde a un polipéptido MT-SP1 modificado que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en una cualquiera de las SEC ID Nº.

4. 51, 56, 57.

6. 64, 67.

41. 429, 434, 435.

43. 442, 445, 524, 525.

52. 530, 532, 533, 560, 568, 614 o 622.

8. Una composición farmacéutica, que comprende una proteasa modificada que no pertenece al complemento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Una combinación, que comprende:

(a) una composición farmacéutica de la reivindicación 8; y

(b) un segundo agente o agentes para el tratamiento de un trastorno mediado por el complemento, en el que el segundo agente es un agente antiinflamatorio o un anticoagulante.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 8, que comprende adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, en la que la composición farmacéutica se formula para administración sistémica, oral, nasal, pulmonar, local o tópica.

12. Un kit que comprende la composición farmacéutica de la reivindicación 8, un dispositivo para la administración de la composición y, opcionalmente, instrucciones para la administración.

13. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cualquiera de las proteasas modificadas que no pertenecen al complemento de las reivindicaciones 1-7.

14. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13.

15. Una célula que comprende el vector de la reivindicación 14.

16. Una proteína de fusión que comprende una parte catalíticamente activa de una proteasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 que está fusionada a un polipéptido que no es una proteasa.

17. Una proteasa modificada que no pertenece al complemento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado entre un trastorno inflamatorio, un trastorno neurodegenerativo y un trastorno cardiovascular, en el que:

la proteasa que no pertenece al complemento escinde uno cualquiera o más sustratos diana de una ruta del complemento de tal manera que se inhibe la activación del complemento en una ruta que comprende el sustrato diana; y la inhibición de la activación del complemento conduce a una reducción de los síntomas inflamatorios asociados a la enfermedad o al trastorno.

18. La proteasa modificada que no pertenece al complemento para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el trastorno mediado por el complemento se selecciona entre septicemia, artritis Reumatoide (AR) , glomerulonefritis membranoproliferativa (GNMP) , Esclerosis Múltiple (EM) , Miastenia grave (MG) , asma, enfermedad intestinal inflamatoria, lesión tisular inflamatoria aguda mediada por el complejo inmune (CI) , Enfermedad de Alzheimer (EA) y lesión de isquemia-reperfusión.

19. La proteasa modificada que no pertenece al complemento para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el trastorno mediado por el complemento es el síndrome de Guillan-Barré.

20. La proteasa modificada que no pertenece al complemento para su uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la lesión de isquemia-reperfusión se produce por un suceso o tratamiento seleccionado entre infarto de miocardio (IM) , ictus, angioplastia, injerto de derivación de arteria coronaria, derivación cardiopulmonar (DCP) y hemodiálisis.

21. La proteasa modificada que no pertenece al complemento para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17-20, en el que el trastorno mediado por el complemento se produce como resultado del tratamiento de un sujeto.

22. La proteasa modificada que no pertenece al complemento para su uso de acuerdo con la reivindicación 21, en el que el tratamiento produce lesión de isquemia-reperfusión mediada por el complemento.

23. La proteasa modificada que no pertenece al complemento para su uso de acuerdo con la reivindicación 22, en el

que el tratamiento es angioplastia o injerto de derivación de arteria coronaria. 10