Conjugados de proteínas no citotóxicos.

Conjugado de proteínas no citotóxico para la inhibición o reducción de la fusión exocítica en una célula aferente sensorial nociceptiva,

que comprende:

(i) una Fracción de reconocimiento (TM),

en el que dicha TM es un agonista de un receptor presente en dicha célula aferente sensorial nociceptiva, y en el que dicho receptor experimenta una endocitosis para incorporarse en un endosoma en el interior de la célula aferente sensorial nociceptiva;

(ii) una proteasa no citotóxica o un fragmento de la misma,

en el que la proteasa o el fragmento de proteasa es capaz de segmentar una proteína del aparato de fusión exocítica de dicha célula aferente sensorial nociceptiva; y

(iii) un Dominio de translocación,

en el que el Dominio de translocación transloca la proteasa o el fragmento de proteasa desde el interior del endosoma, a través de la membrana endosómica, y en el citosol de la célula aferente sensorial nociceptiva, en el que la TM y el Dominio de translocación están separados por un espaciador que tiene una secuencia de aminoácidos de 20-29 restos de aminoácidos.

Conjugados de proteínas no citotóxicos

5 [0001] La presente invención se refiere a un conjugado de proteína no citotóxico, y al uso de dicho conjugado para el tratamiento del dolor.

[0002] Las toxinas pueden dividirse generalmente en dos grupos según el tipo de efecto que tienen en una célula diana. Más en detalle, el primer grupo de toxinas destruye sus células diana naturales, y por tanto son

10 conocidas como moléculas de toxinas citotóxicas. Este grupo de toxinas se ilustra, entre otros, por toxinas vegetales como ricina y abrina, y por toxinas bacterianas como toxina de la difteria y exotoxina A de Pseudomonas. Normalmente, las toxinas citotóxicas destruyen sus células diana por la inhibición del proceso celular de síntesis de proteínas.

15 [0003] En cambio, el segundo grupo de toxinas, que son conocidas como toxinas no citotóxicas, no destruyen (como confirma su nombre) sus células diana naturales. Las toxinas no citotóxicas han atraído mucho menos interés comercial que sus alternativas citotóxicas, y ejercen sus efectos en una célula diana mediante la inhibición de procesos celulares distintos de la síntesis de proteínas. Al igual que sus alternativas citotóxicas, las toxinas no citotóxicas se producen a partir de una diversidad de fuentes como plantas y bacterias. A continuación se describen

20 en más detalle las toxinas no citotóxicas bacterianas.

[0004] Las neurotoxinas clostridiales son proteínas que tienen normalmente una masa molecular del orden de 150 kDa. Son producidas por diversas especies de bacterias, especialmente del genero Clostridium, de forma muy significativa C. tetani y varias cepas de C. botulinum, C. butyricum y C. argentinense. En la actualidad existen ocho

25 clases diferentes de la neurotoxina clostridial, que son: toxina tetánica y neurotoxina botulínica en sus serotipos A, B, C-i, D, E, F y G, y todas comparten estructuras y modos de acción similares.

[0005] Las neurotoxinas clostridiales representan un grupo importante de moléculas de toxinas no citotóxicas, y son sintetizadas por la bacteria hospedadora como polipéptidos únicos que son modificados post-

30 traduccionalmente por un episodio de segmentación proteolítica para formar dos cadenas de polipéptidos unidas entre sí por un enlace de disulfuro. Las dos cadenas se denominan cadena pesada (cadena H), que tiene una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y cadena ligera (cadena L), que tiene una masa molecular de aproximadamente 50 kDa.

35 [0006] Las cadenas L poseen una función proteasa (actividad de endopeptidasa dependiente del cinc) y

muestran alta especificidad de sustratos para proteínas asociadas a membrana vesicular y/o plasmática implicadas en el procedimiento exocítico. Las cadenas L de diferentes especies o serotipos clostridiales pueden hidrolizar enlaces peptídicos diferentes pero específicos en una de tres proteínas sustrato, que son sinaptobrevina, sintaxina o SNAP-25. Estos sustratos son componentes importantes de la maquinaria neurosecretora.

[0007] Las toxinas no citotóxicas son producidas también por otras bacterias, como las del género Neisseria, de forma muy destacada de las especies N. gonorrhoeae. Por ejemplo, Neisseria sp. produce la IgA proteasa de toxina citotóxica (véase el documento WO-99/58.571).

45 [0008] Está bien documentado en la técnica que las moléculas de toxinas pueden ser redirigidas a una célula que no es la célula diana natural de la toxina. Cuando se redirige, la toxina modificada es capaz de unirse a una célula diana deseada y, después de la translocación posterior en el citosol, es capaz de ejercer su efecto en la célula diana. Dicho redireccionamiento se consigue sustituyendo la Fracción de reconocimiento (TM) natural de la toxina por una TM diferente. A este respecto, la TM se selecciona de manera que se unirá a una célula diana deseada, y

50 permite el paso posterior de la toxina modificada en un endosoma en el interior de la célula diana. La toxina modificada también comprende un dominio de translocación para permitir la entrada de la proteasa no citotóxica en el citosol de la célula. El dominio de translocación puede ser el dominio de translocación natural de la toxina o puede ser un dominio de translocación diferente obtenido de una proteína microbiana con actividad de translocación.

55 [0009] Por ejemplo, en el contexto de moléculas de toxinas no citotóxicas, se ha documentado bien que una neurotoxina clostridial puede ser redirigida por incorporación de una Fracción de reconocimiento (TM), que no está en la TM natural de una neurotoxina clostridial. Las metodologías descritas de conjugación química y recombinantes se contemplan actualmente como convencionales, y se hace referencia a Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press, y a Wong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press.

[0010] Por ejemplo, el documento WO-94/21.300 describe moléculas de neurotoxinas clostridiales modificadas que son capaces de regular la densidad de Proteínas Integrales de Membrana (IMP) presentes en la superficie celular de la célula diana. Las moléculas de neurotoxinas modificadas son así capaces de controlar la actividad celular (por ejemplo, recaptación de glucosa) de la célula diana. Los documentos WO-96/33.273 y WO-

65 99/17.806 describen moléculas de neurotoxinas clostridiales modificadas que se dirigen a aferentes sensoriales periféricos. Las moléculas de neurotoxinas modificadas son así capaces de mostrar un efecto analgésico. El

documento WO-OO/10.598 describe la preparación de moléculas de neurotoxlnas clostrldlales modificadas que se dirigen a células hipersecretoras de mucosidad (o células neuronales que controlan a dichas células hipersecretoras de mucosidad), neurotoxinas modificadas que son capaces de inhibir la hipersecreclón de dichas células. El documento WO-01/21.213 describe moléculas de neurotoxinas clostridiales modificadas que se dirigen a una amplia 5 variedad de tipos diferentes de células diana no neuronales. Las moléculas modificadas son así capaces de impedir la secreción desde las células diana. Entre las publicaciones adicionales en el campo técnico de moléculas de toxinas redirigidas se incluyen los documentos: WO-OO/62.814; WO-00/04.926; US-5.773.586; WO-93/15.766; WO- 00/61.192; y WO-99/58.571.

10 [0011] Así, a partir de las publicaciones descritas anteriormente, se observará que el concepto básico de

redireccionamiento de una proteasa no citotóxica en una célula diana deseada, por selección de una TM que tiene un receptor correspondiente presente en la célula diana, ha sido bien documentado.

[0012] Sin embargo, diferentes receptores presentes en una célula diana de Interés muestran diferentes 15 afinidades de unión para diferentes TM. Esto puede constituir un problema sobre todo en células de percepción del

dolor, que poseen una amplia variedad de tipos de receptores que presentan diferentes afinidades de unión para diferentes TM. Así, un conjugado redirigido que comprende una TM determinada (que se une a un receptor en una célula de percepción del dolor) puede mostrar una baja afinidad de unión para una célula diana de percepción del dolor, lo cual no es deseable.

[0013] Por tanto, existe la necesidad de desarrollar conjugados no citotóxicos modificados que aborden uno o más de los problemas anteriores. De particular interés es el desarrollo de un conjugado mejorado para su uso en el

tratamiento del dolor.

25 [0014] La presente invención pretende abordar uno o más de los problemas anteriores usando como

Fracción de reconocimiento (TM) del conjugado un "agonista" de un receptor que está presente en la célula diana de percepción del dolor de interés. En formas de realización preferidas, la célula diana de percepción del dolor es un aferente sensorial nociceptivo, más preferentemente un aferente sensorial nociceptivo primario. En formas de realización preferidas en particular, la TM es un agonista del receptor de tipo opioide-1 (ORL-i).

[0015] El documento US5989545 describe derivados de la toxina clostridial capaces de modificar las funciones aferentes sensoriales periféricas.

[0016] El documento EO1422240 describe análogos de péptldos de noclceptlna.

[0017] El documento W02004/024909 y el documento WO 98/07864 describen fragmentos de toxinas recombinantes.

[0018] En un primer aspecto, la presente Invención proporciona un conjugado no cltotóxlco tal como se Indica 40 en las reivindicaciones.

[0019] El uso de un "agonista", que estimularía normalmente un procedimiento biológico, en particular exocitosis (por ejemplo, un aumento en... [Seguir leyendo]

1. Conjugado de proteínas no citotóxico para la inhibición o reducción de la fusión exocítica en una célula aferente sensorial nociceptiva, que comprende:

5 (i) una Fracción de reconocimiento (TM),

en el que dicha TM es un agonista de un receptor presente en dicha célula aferente sensorial nociceptiva, y en el que dicho receptor experimenta una endocitosis para incorporarse en un endosoma en el interior de la célula aferente sensorial nociceptiva;

(ii) una proteasa no citotóxica o un fragmento de la misma,

10 en el que la proteasa o el fragmento de proteasa es capaz de segmentar una proteína del aparato de fusión exocítica de dicha célula aferente sensorial nociceptiva; y

(iii) un Dominio de translocación,

en el que el Dominio de translocación transloca la proteasa o el fragmento de proteasa desde el interior del endosoma, a través de la membrana endosómica, y en el citosol de la célula aferente sensorial nociceptiva,

15 en el que la TM y el Dominio de translocación están separados por un espaciador que tiene una secuencia de aminoácidos de 20-29 restos de aminoácidos.

2. Conjugado de proteínas no citotóxico, según la reivindicación 1, en el que la TM y el dominio de translocación están separados por un espaciador que tiene una secuencia de aminoácidos de 20-27 restos de aminoácidos.

3. Conjugado de proteínas no citotóxico, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la TM se selecciona del grupo que consiste en: un péptido agonista del receptor ORL-i; una endomorfina-1; una endomorfina- 2; una encefalina; una p-endorfina; un opioide; un lofentanilo; una etorfina; una nociceptina; una dinorfina; y fragmentos de los mismos.

4. Conjugado de proteínas no citotóxico, según la reivindicación 3, en el que dicho TM de encefalina es una met- encefalina o una leu-encefalina.

5. Conjugado de proteínas no citotóxico, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el receptor es un

30 receptor ORLi.

6. Conjugado de proteínas no citotóxico, según la reivindicación 3, en el que la TM de nocicpetina tiene al menos un 70% o al menos un 80% de homología con la SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 o un fragmento de la misma.

35 7. Conjugado de proteínas no citotóxico, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteasa no citotóxica es una proteína bacteriana, o un fragmento de la misma, capaz de segmentar una proteína del aparato de fusión exocítica de la célula aferente sensorial nociceptiva;

preferiblemente en el que la proteasa no citotóxica es una proteasa de neurotoxina clostridial o una proteasa de IgA.

40 8. Conjugado de proteínas no citotóxico, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el Dominio de translocación es un dominio de translocación de neurotoxina clostridial; preferiblemente en el que el Dominio de translocación es un dominio Hn botulínico.

9. Conjugado de proteínas no citotóxico, según la reivindicación 8, en el que el dominio Hn botulínico es codificado 45 por la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 28, 30 ó 32.

10. Conjugado de proteínas no citotóxico, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula aferente sensorial nociceptiva es una célula aferente sensorial nociceptiva primaria.

50 11. Conjugado de proteínas no citotóxico según la reivindicación 1, en el que dicho conjugado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO. 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 73, 76, 79, 81, 83, 85, 88, 91, 94, 97 y 100.

12. Conjugado de proteínas no citotóxico, según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la TM, el Dominio 55 de translocación y la proteasa o fragmento de la misma están unidos covalentemente.

13. Composición farmacéutica, que comprende un conjugado de proteínas no citotóxico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y un portador farmacéuticamente aceptable.

60 14. Utilización de un conjugado de proteínas no citotóxico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una composición, según la reivindicación 13, para la fabricación de un medicamento para tratar el dolor.

15. Conjugado de proteínas no citotóxico, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una composición, según la reivindicación 13, para utilizar en el tratamiento o supresión del dolor.