Estándares de células estimuladas.

Un método para preparar material de referencia celular que comprende las etapas de:

(a) proveer una muestra de células que ha sido aislada previamente a partir de un cuerpo humano o animal, comprendiendo dicha muestra de células células seleccionadas del grupo consistente de:

células mononucleares sanguíneas periféricas;

líneas celulares;

trombocitos;

(b) estimular dichas células para producir citoquinas en la presencia de un inhibidor de secreción de citoquinas;

(c) fijar dichas células estimuladas mediante la adición de un fijador;

(d) conservar dichas células estimuladas fijas por liofilización.

Estándares de células estimuladas Campo de la invención La invención se relaciona con materiales de referencia de control estándar para uso en ensayos de citoquina. La invención también se relaciona con métodos para producir tales materiales.

Antecedentes y técnica conocida para el solicitante La detección de la liberación de citoquina por el ensayo ELISPOT y la cuantificación e identificación de citoquinas intracelulares por citometría de flujo se usan ampliamente juntas como índices de las respuestas inmunes mediadas por células. En el así llamado ensayo ELISPOT, las citoquinas liberadas a partir de células inmovilizadas interactúan típicamente con un inmunoensayo, tal como un ensayo ELISA, para producir una “mancha” coloreada sobre la placa de ensayo proveyendo información tanto cualitativa (por ejemplo tipo de proteína inmune) y cuantitativa (número o proporción de células que responden) . La estandarización de estos ensayos requiere el desarrollo de estándares de referencia confiables para monitorear los niveles de citoquina intracelulares y la liberación de citoquina en las muestras de ensayo, permitiendo así comparaciones entre diferentes laboratorios y pruebas.

Las células estimuladas (positivas a la citoquina) , fijadas, criopreservadas están disponibles comercialmente para citometría de flujo intracelular (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido) , y células no estimuladas liofilizadas están disponibles bien sea como controles para tinción en superficie o para propósitos de análisis hematológicos (Beckman Coulter UK Ltd, High Wycombe, Reino Unido) . Maecker et al. (BMC Immunology 2005, 6:13) divulgan muestras de sangre enteras activadas, fijadas y criopreservadas para estandarizar citometría de flujo de citoquina o tinción de citoquina intracelular.

Para los ensayos ELISPOT, u otros ensayos donde se monitorea la liberación de citoquina a partir de células, solamente están disponibles actualmente células vivas criopreservadas a partir de donantes individuales.

Las metodologías actualmente disponibles para la provisión de un material de referencia estandarizado tienen un cierto número de desventajas: con el fin de estandarizar los materiales de referencia en un gran número de laboratorios en todo el mundo, y para proveer materiales de referencia que puedan ser utilizados a lo largo de años, se requiere una gran cantidad de material estable. Sin embargo, las células vivas a partir de donantes múltiples no pueden ser juntadas para hacer lotes individuales grandes debido a las reacciones linfocíticas mixtas, resultantes en muerte celular y sobreexpresión de citoquinas.

Las células criopreservadas también requieren almacenamiento especializado utilizando, por ejemplo nitrógeno líquido y embarque en hielo seco, incrementando así los costes. También existe el riesgo de descongelamiento y recongelamiento durante el embarque, en el evento de fallas de energía de los dispositivos de refrigeración, por decir algo, llevando al deterioro del material, haciéndolo así inútil como estándar de referencia. Adicionalmente, las células criopreservadas deben ser descongeladas cuidadosamente para asegurar la consistencia de las respuestas. Se ha demostrado que es muy difícil obtener resultados consistentes entre laboratorios que utilizan esta metodología.

La carencia de materiales de referencia adecuados para tales ensayos de citoquina impide metodologías de pruebas robustas, especialmente con respecto a la comparación entre diferentes laboratorios y ensayos. Está dentro de los objetivos de la presente invención buscar una solución a estos problemas.

Resumen de la invención De acuerdo con lo anterior, en un primer aspecto, la invención provee un método para preparar material de referencia celular que comprende las etapas de: (a) proveer una muestra de células que haya sido previamente aislada a partir de un cuerpo humano o animal, comprendiendo dicha muestra de células, células seleccionadas del grupo consistente de: células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) (tales como basófilos, neutrófilos, eosinófilos, monocitos, linfocitos (linfocitos B y linfocitos T) y células asesinas naturales) , trombocitos y líneas celulares; (b) estimular dichas células para producir citoquinas en la presencia de un inhibidor de la secreción de citoquina; (c) fijar dichas células estimuladas mediante la adición de un fijador; (d) preservar dichas células estimuladas fijadas por liofilización.

Por líneas celulares, entendemos un cultivo celular capaz de proliferación dados un medio fresco y espacio apropiados, siendo tales células aisladas originalmente a partir de un cuerpo humano o animal, y capaces de la producción de citoquina. Tales células pueden producir bien sea citoquinas de manera inherente, o pueden ser modificadas para incluir material genético exógeno que codifica para, y lleva a la síntesis de, una o más citoquinas, por ejemplo, incluyendo pero no restringiéndose a TNF-a, IFN-y, IL-1 e IL-6. El ADN exógeno puede ser introducido en una célula eucariote receptora, por ejemplo por microinyección, electroporación, el uso de fosfato de calcio o un

reactivo de transfección liposómico, y dicho material genético puede ser integrado subsecuentemente en el ADN cromosómico de dichas células, o puede permanecer presente, por ejemplo, como un plásmido. Para células que son capaces de producir citoquinas de manera inherente, tales células pueden ser modificadas, por ejemplo, mediante la introducción de secuencias promotoras para superregular la producción de citoquinas. Las células pueden ser estimuladas si se requiere, por ejemplo, mediante el uso de un mitógeno, para producir citoquinas y ser preservadas de acuerdo con las técnicas descritas aquí.

La transducción de un gen de citoquina en células neoplásticas es conocida por generar una reacción fuertemente inflamatoria en el huésped (por ejemplo, véase “The boosting effect of co-transduction with cytokine genes on cancer vaccine therapy using genetically modified dendritic cells expressing tumor-associated antigen", International journal of oncology; OJIMA Toshiyasu et al: ISSN 1019-6439 2006, vol. 28, no4, pp.947-953) . In vivo, esto impide el crecimiento tumoral. In vitro, las citoquinas intracelulares pueden ser preservadas de acuerdo con las técnicas descritas aquí.

Tales líneas celulares pueden incluir líneas celulares derivadas de basófilos, neutrófilos, eosinófilos, monocitos, linfocitos (linfocitos B y linfocito T) , células asesinas naturales (todas las células mononucleares sanguíneas periféricas, PBMC) y trombocitos, o líneas celulares tales como HeLa, HL-60, A-549, Jurkat, LNCap y CAPAN 1.

En realizaciones preferidas, la invención provee un método para preparar material de referencia celular que comprende las etapas de: (a) proveer una muestra celular que ha sido aislada previamente a partir de un cuerpo humano o animal, comprendiendo dicha muestra de células células seleccionadas del grupo consistente de: células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) , y trombocitos; (b) estimular dichas células para producir citoquinas en la presencia de un inhibidor de secreción de citoquinas; (c) fijar dichas células estimuladas por adición de un fijador; (d) preservar dichas células estimuladas fijadas mediante liofilización.

En un segundo aspecto independiente, la invención también provee un método para preparar material de referencia celular que comprende las etapas de: (i) proveer una población celular mixta que haya sido aislada previamente a partir de un cuerpo humano o animal, comprendiendo dicha población celular mixta una pluralidad de tipos de células seleccionados del grupo consistente de: células mononucleares sanguíneas periféricas; trombocitos; (ii) fraccionar dicha población de células mixtas para producir una pluralidad de fracciones que tiene poblaciones distintas de tipos celulares dentro de cada fracción; (iii) estimular las células dentro de una o más de dichas fracciones para producir citoquinas en la presencia de un inhibidor de la secreción de citoquinas; (iv) fijar dichas células dentro de cada fracción mediante la adición de un fijador; (v) recombinar una pluralidad de dichas fracciones para producir una mezcla de células estimuladas diferencialmente; (vi) preservar dicha mezcla de células estimuladas diferencialmente por liofilización.

De esta manera, pueden ser producidos los estándares de referencia que imitan un patrón particular de expresión de citoquina en diferentes tipos de células. Tales estándares de expresión de citoquina proveerían un beneficio tanto en los trabajos clínicos como de investigación ayudando en ambos casos en el diagnóstico/prognosis... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar material de referencia celular que comprende las etapas de:

(a) proveer una muestra de células que ha sido aislada previamente a partir de un cuerpo humano o animal, comprendiendo dicha muestra de células células seleccionadas del grupo consistente de: células mononucleares sanguíneas periféricas;

líneas celulares; trombocitos;

(b) estimular dichas células para producir citoquinas en la presencia de un inhibidor de secreción de citoquinas;

(c) fijar dichas células estimuladas mediante la adición de un fijador;

(d) conservar dichas células estimuladas fijas por liofilización.

2. Un método para preparar material de referencia celular que comprende las etapas de:

(i) proveer una población celular mixta que ha sido aislada previamente a partir de un cuerpo humano o animal, comprendiendo dicha población celular mixta una pluralidad de tipos de células seleccionadas del grupo consistente de:

células mononucleares sanguíneas periféricas;

trombocitos;

(ii) fraccionar dicha población de células mixtas para producir una pluralidad de fracciones que tienen poblaciones distintas de diferentes tipos celulares dentro de cada fracción:

(iii) estimular las células dentro de una o más de dichas fracciones para producir citoquinas en la presencia de un inhibidor de secreción de citoquinas;

(iv) fijar dichas células dentro de cada fracción mediante la adición de un fijador,

(v) recombinar una pluralidad de dichas fracciones para producir una mezcla de células diferencialmente estimuladas;

(vi) preservar dicha mezcla de células diferencialmente estimuladas por liofilización.

3. Un método de acuerdo bien sea con la reivindicación 1 o reivindicación 2 en donde dicha muestra o población de células ha sido aislada a partir de un cuerpo de mamífero.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha muestra o población de células ha sido aislada a partir de un cuerpo humano.

5. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde dichas células son estimuladas mediante la adición de un mitógeno.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5 en donde dicho mitógeno comprende PMA (formol-12-miristato-13acetato) , o lonomicina, o una mezcla de los mismos.

7. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en donde dicho inhibidor de secreción de citoquinas comprende Brefeldin A.

8. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en donde dicho fijador comprende paraformaldehído.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8 en donde dicho fijador comprende una mezcla de paraformaldehído y cloruro de cromo.

10. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que comprende adicionalmente la etapa de eliminar el fijador residual después de fijar dichas células y antes de conservar dichas células.

11. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que comprende adicionalmente la etapa de exponer dichas células fijadas a condiciones hipertónicas antes de conservar dichas células.

12. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que comprende adicionalmente la etapa de agregar un crioconservante a dichas células fijadas antes de conservar dichas células.

13. Un método para preparar material celular de referencia que comprende las etapas de:

proveer una pluralidad de muestras de células que han sido aisladas previamente a partir de una pluralidad de individuos;

llevar a cabo el método de cualquier reivindicación precedente dependiente de la reivindicación 1 en cada muestra de células;

y adicionalmente comprende la etapa de combinar células fijadas derivadas a partir de una pluralidad de dichas muestras antes de conservar dichas células.

14. Un método para preparar material celular de referencia que comprende las etapas de:

proveer una pluralidad de poblaciones celulares mixtas que han sido aisladas previamente a partir de una pluralidad de individuos;

llevar a cabo el método de cualquier reivindicación precedente dependiente de la reivindicación 2 sobre cualquier población celular mixta;

y comprende adicionalmente la etapa de combinar células fijadas derivadas de una pluralidad de dichas poblaciones celulares mixtas antes de conservar dichas células.

15. Un método para preparar material celular de referencia que comprende las etapas de:

preparar células fijadas no estimuladas de acuerdo con las etapas de método de cualquier reivindicación precedente en las cuales la etapa de estimulación (b) o (iii) es omitida y en la cual la etapa de conservación (d) o (vi) es omitida;

combinar dichas células fijadas no estimuladas con células fijadas estimuladas preparadas de acuerdo con las etapas de método de cualquier reivindicación precedente en la cual la etapa de conservación (d) o (vi) es omitida; y conservar dichas células combinadas por liofilización.