Células y mamíferos no humanos modificados genéticamente.

Un roedor o célula de roedor modificado(a) genéticamente, caracterizado por que el gen que codifica el polipéptido MASP-2 endógeno y/o el gen que codifica el polipéptido MAp19 endógeno está(n) ausente(s) o parcialmente ausente(s) o desorganizados de tal modo que no se produce el polipéptido MASP-2 endógeno de roedor y/o MAp19 endógeno de roedor.

Células y mamíferos no humanos modificados genéticamente Campo de la invención

La presente Invención se refiere a mamíferos no humanos modificados genéticamente, en particular a roedores modificados genéticamente, tales como ratones, que no producen cantidad alguna de polipéptido endógeno serina- proteasa-2 asociado a la lectina fijadora de manano (MASP-2). La Invención se refiere también a células no humanas modificadas genéticamente, en particular células del tallo embrionario, especialmente células de roedores tales como células de ratón, que no producen cantidad alguna del polipéptido MASP-2 endógeno. La Invención se refiere también a células no humanas modificadas genéticamente, en particular células del tallo embrionario y mamíferos no humanos modificados genéticamente producidos a partir de ellas, y su uso en la producción de mamíferos y células no humanos de los cuales se han delecionado o desorganizado dentro del genoma los genes endógenos MASP-2. Aspectos de la Invención se refieren también a mamíferos y células no humanos modificados genéticamente que no producen cantidad alguna de proteína 19 endógena asociada a lectina fijadora de manano (MAp 19).

Antecedentes de la invención

El sistema del complemento proporciona un mecanismo de acción temprana para iniciar y ampliar la respuesta inflamatoria a la infección microbiana y otras agresiones agudas (Liszewski, M.K. y J.P. Atklnson, 1993, en Fundamental Immunology, tercera edición, editado por W.E. Paul, Raven Press, Ltd., Nueva York). Si bien la activación del complemento proporciona una defensa valiosa de primera línea contra patógenos potenciales, las actividades del complemento que promueven una respuesta inflamatoria protectora pueden representar también una amenaza potencial para el hospedador (Kalll, K.R., et al., Springer Semin. Immunopathol. 15:417- 431, 1994; Morgan, B.P., Eur. J. Clinical Investlg. 24:219-228, 1994). Por ejemplo, los productos proteolítlcos de C3 y C5 reclutan y activan los neutrófilos. Estas células activadas están indiscriminadas en su liberación de enzimas destructoras y pueden causar deterioro oigánlco. Además, la activación del complemento puede causar la deposición de componentes liticos del complemento en las células hospedadoras cercanas así como en las dianas microbianas, dando como resultado lisis de las células hospedadoras.

El sistema del complemento se ha visto implicado como contribuyente a la patogénesis de numerosos estados de enfermedad agudos y crónicos, que incluyen: infarto de miocardio, revascularizaclón subsiguiente a derrame cerebral, ARDS, lesión de reperfusión, choque séptico, fuga capilar subsiguiente a quemaduras témnlcas, inflamación pos-derivación cardiopulmonar, rechazo de trasplantes, artritis reumatolde, esclerosis múltiple, mlastenla grave, y enfermedad de Alzheimer. En la práctica totalidad de estas afecciones, el complemento no es la causa, pero es uno de los varios factores implicados en la patogénesis. Sin embargo, la activación del complemento puede ser un mecanismo patológico importante y representa un punto eficaz para control clínico en muchos de estos estados de enfermedad. El reconocimiento creciente de la importancia de una lesión tisular mediada por el complemento en una diversidad de estados de enfermedad pone de manifiesto la necesidad de fármacos eficaces inhibidores del complemento. No ha sido aprobado fármaco alguno para uso humano que esté dirigido a e inhiba específicamente la activación del complemento.

En la actualidad, está aceptado generalmente que el sistema del complemento puede ser activado por 3 vías distintas: la vía clásica, la vía de lectina, y la vía alternativa. La vía clásica se desencadena usualmente por fijación de anticuerpo a una partícula extraña (es decir, un antígeno), y requiere por tanto exposición previa a dicho antígeno para la generación del anticuerpo específico. Dado que la activación de la vía clásica está asociada con el desarrollo de una respuesta inmune, la vía clásica forma parte el sistema inmune adquirido. En contraste, tanto la vía de lectina como la vía alternativa son independientes de la inmunidad clonal yforman parte del sistema inmune innato.

El primer paso en la activación de la vía clásica es la fijación de una molécula de reconocimiento específica, C1q, a las IgG e IgM fijadas al antígeno. La activación del sistema del complemento da como resultado la activación secuendal de zimógenos serina-proteasa. C1q está asociada con las proenzimas serina-proteasa C1ry C1s como un complejo denominado C1 y, después de la fijación de C1q a un complejo inmune, la escisión auto-proteolítica del sitio Arg-lie de C1r va seguida por la activación por C1r de C1s, que adquiere con ello la capacidad de escindir C4 y C2. La escisión de C4 en dos fragmentos, designados C4a yC4b permite que los fragmentos C4b formen enlaces covalentes con grupos hidroxilo o amino adyacentes y la generación subsiguiente de la convertasa C3 (C4b2b) por interacción no covalente con el fragmento C2b de C2 activado. La convertasa C3 (C4b2b) activa C3 conduciendo a la generación de la convertasa C5 (C4b2b3b) y la formación del complejo de ataque de la membrana (C5b-9) que puede causar lisis microbiana. Las formas activadas de C3 y C4 (C3b y C4b) se depositan covalentemente en las superficies diana extrañas, que son reconocidas por receptores del complemento en fagocitos múltiples.

Independientemente, el primer paso en la activación del sistema del complemento por la vía de lectina es también la fijación de moléculas de reconocimiento específicas, que va seguida por la activación de se rina-p roteas as asociadas. Sin embargo, más bien que la fijación de cotejos inmunes porClq, las moléculas de reconocimiento en la

vía de lectina son proteínas séricas fijadoras de carbohidratos (lectina fijadora de manano (MBL), ficolina H, ficolina M, y ficolina L) (Lu, J., et al., Biochim. Biophys. Acta 1572:387-4, 22). Ikeda et al. demostraron por primera vez que, al igual que C1q, MBL podría activar el sistema del complemento después de fijación a eritrocitos recubiertos de manano de levadura de una manera dependiente de C4 (Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem. 262:7451- 7454, 19 8 7). MBL, un miembro de la familia de proteínas colectinas, es una lectina dependiente de calcio que fija carbohidratos con 3 y4 grupos hidroxi orientados en el plano ecuatorial del anillo de piranosa. Ligandos prominentes para MBL son por tanto D-manosa y N-acetil-D-glucosamina, mientras que los carbohidratos que no se ajustan a este requerimiento estérico tienen afinidad indetectable para MBL (Weis, W.I., et al., Nature 36:127-134,1992). La interacción entre MBL y los azúcares monovalentes es extremadamente débil, con constantes de disociación comprendidas típicamente en el campo 2 mM. MBL consigue la fijación fuerte específica a ligandos glucano por interacción simultánea con residuos monosacáridos múltiples (Lee, R.T., et al., Archiv. Biochem. Biophys. 299:129- 136, 1992). MBL reconoce los patrones de carbohidrato que decoran comúnmente microorganismos tales como bacterias, levadura, parásitos y ciertos virus. En contraste, MBL no reconoce D-galactosa y ácido siálico, los azúcares penúltimo y último que decoran usualmente los glicoconjugados complejos `maduros presentes en las glicoproteínas plasmáticas y de la superficie celular de los mamíferos. Se cree que esta especificidad de fijación contribuye a la protección contra la autoactivación. Sin embargo, MBL se fija de hecho con afinidad alta a agrupaciones de glucanos `precursores ricos en mañosa en las glicoproteínas unidas a N y los glicolípidos secuestrados en el retículo endoplásmico y el Golgi de las células de mamífero (Maynard, Y., et al., J. Biol. Chem. 257:3788-3794, 1982). Por tanto, las células deterioradas son dianas potenciales para la activación de la vía de lectina por fijación de MBL.

Las ficolinas poseen un tipo de dominio de lectina diferente de MBL, denominado el dominio de tipo fibrinógeno. Las ficolinas fijan residuos azúcar de una manera independiente de Ca++. En los humanos, se han identificado tres clases de ficolinas, ficolina L, ficolina M y ficolina H. Las dos ficolinas del suero ficolina Lyficolina H tienen en común una especificidad para N-acetil-D-glucosamina; sin embargo, la ficolina H se fija también a N-acetil-D-galactosamina. La diferencia en especificidad de azúcares de ficolina L, ficolina H y MBL significa que las diferentes lectinas pueden ser complementarias y estar dirigidas a glicoconjugados diferentes, aunque solapantes. Este concepto está respaldado por un informe reciente según el cual, de las lectinas conocidas en la vía de lectina, únicamente ficolina L se fija específicamente... [Seguir leyendo]

1. Un roedor o célula de roedor modificado(a) genéticamente, caracterizado por que el gen que codifica el polipéptido MASP-2 endógeno y/o el gen que codifica el polipéptido MAp19 endógeno está(n) ausente(s) o parcialmente ausente(s) o desorganizados de tal modo que no se produce el polipéptido MASP-2 endógeno de roedor y/o MAp19 endógeno de roedor.

2. Un roedor o célula de roedor modificado(a) genéticamente según la reivindicación 1, caracterizado por que el gen que codifica el polipéptido MASP-2 está desorganizado del genoma de tal modo que no se produce el polipéptido MASP-2 endógeno de roedor.

3. Un roedor o célula de roedor modlficado(a) genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que (I) el mismo puede obtenerse o se obtiene por deleclón deliberada de prácticamente todas las secuencias endógenas del gen MASP-2 y/o MAp19 y/o (¡I) están presentes en el genoma uno o más marcadores seleccionabas, en donde el o los marcadores seleccionabas es/son uno o más marcadores seleccionares seleccionados de un grupo que comprende un gen de resistencia a neomlclna, un gen de resistencia a puromlclna, y un gen de resistencia a higromicina.

4. Un roedor o célula de roedor modlficado(a) genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que es un ratón o célula de ratón.

5. Una célula de roedor modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que la célula de roedor es una célula del tallo embrionario.

6. Un roedor modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, derivado de un roedor modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. Un roedor modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, derivado de una célula de roedor modificada genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

8. Una célula de roedor modificada genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 derivada de un roedor modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

9. Un roedor o célula de roedor modlficado(a) genéticamente, caracterizado por que los exones 1, 11 y 12 del gen MASP-2 endógeno están deleclonados del genoma.

1. Un método para producir una célula de roedor modificada genéticamente que comprende: transfectar una célula de roedor con un constructo de dlrecclonamlento para integración aguas arriba de, o dentro del gen MASP-2 o MAp19, comprendiendo dicho constructo de dlreccionamiento una secuencia de recombinación de direccionamiento y un marcador seleccionare, seleccionar una célula en la cual está presente el marcador seleccionare y someter a cribado dicha célula respecto a Integración de la secuencia de recombinación, en donde dicha célula modificada genéticamente se caracteriza porque el gen que codifica el polipéptido MASP-2 endógeno y/o el gen que codifica el polipéptido MAp19 endógeno está/están ausentes o parcialmente ausentes o desorganizados de tal modo que el polipéptido MASP-2 endógeno de roedor y/o MAp19 endógeno de roedor no se produce.

11. Un método según la reivindicación 1, caracterizado por que (I) la célula de roedor modificada genéticamente es una célula de ratón y/o (¡I) la célula de roedor modificada genéticamente es una célula del tallo embrionario.

12. El uso de una célula del tallo embrionario de la reivindicación 5, o una célula que puede obtenerse por un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 u 11, para la producción de un roedor modificado genéticamente según la reivindicación 1.

13. Un método para producir un roedor modificado genéticamente capaz de expresar uno o más genes exógenos, que comprende reproducir un roedor modificado genéticamente, caracterizado por que el gen que codifica el polipéptido MASP-2 endógeno y/o el gen que codifica el polipéptido MAp19 endógeno está/están ausente(s) o parcialmente ausente(s) o desorganizado^) de tal modo que el polipéptido MASP-2 endógeno de roedor y/o el polipéptido MAp19 endógeno de roedor no se produce(n), con un roedor compatible que codifica y es capaz de expresar uno o más genes exógenos, para obtener progenie heteroclgótlca para el uno o más genes exógenos, y cruzar opcionalmente la progenie heteracigótica para producir progenie homocigótica respecto al uno o más genes exógenos.

14. Un método para producir un roedor o célula de roedor modificado(a) genéticamente capaz de expresar uno o más genes exógenos, que comprende introducir uno o más genes exógenos en la célula de roedor, caracterizado por que el gen que codifica el polipéptido MASP-2 endógeno y/o el gen que codifica el

polipéptido endógeno MAp19 está/están ausentes o parcialmente ausentes o desorganizados según las reivindicaciones 1 a 5 u 8.

15. Un método según la reivindicación 14, caracterizado por que la célula de roedor es una célula del tallo embrionario, en donde se introducen uno o más genes exógenos por transfección o la célula de roedores un oocito (célula huevo), en donde los uno o más genes exógenos se introducen por microinyección de DNA.

16. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, caracterizado porque los uno o más genes exógenos se insertan en el genoma del roedor o la célula de roedor.

17. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado por que el roedor modificado genéticamente es un ratón, en donde el gen o genes exógenos es un gen MASP-2 humano o MAp19 humano.

18. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado por que el gen o genes exógenos son un gen humano o genes humanos.

19. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que los exones 1, 11, y 12 del gen MASP-2 endógeno están delecionados y/o el exón 5 del gen MAp19 endógeno está delecionado.

2. Un roedor o célula de roedor modificado(a) genéticamente, caracterizado por que es capaz de expresar uno o más genes exógenos y por que el gen que codifica el polipéptido MASP-2 endógeno y/o el gen que codifica el polipéptido MAp19 endógeno está/están ausentes o parcialmente ausentes o desorganizados de tal manera que el polipéptido MASP-2 endógeno de roedor y/o el polipéptido MAp19 endógeno de roedor no se produce, que puede obtenerse por un método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19.

21. Un método para producción de un anticuerpo dirigido contra una proteína MASP-2 humana y/o una proteína MAp19 humana, que comprende administrar una proteína MASP-2 humana y/o una proteína MAp19 humana a un roedor respectivo modificado genéticamente según la reivindicación 1 ó 2.

22. El método de la reivindicación 21, en donde el roedor modificado genéticamente es un ratón.

23. Un roedor o célula de roedor modificado(a) genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el exón 5 del gen MASP-2 endógeno está delecionado.

24. Un roedor o célula de roedor modificado(a) genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que carece de una respuesta de la vía del complemento de lectina.