Anticuerpos monoclonales anti-VAP-1 completamente humanos.

Un anticuerpo anti-VAP-1 o un fragmento de unión a VAP-1 del mismo,

caracterizado porque es completamente humano y comprende un polipéptido de la cadena pesada representado en el SEQ ID NO: 47 o su variante de secuencia conservativa, y un polipéptido de la cadena ligera representado en el SEQ ID NO: 48 o su variante de secuencia conservativa;

en donde el anticuerpo anti-VAP-1 o un fragmento de unión a VAP-1 del mismo muestran un perfil de concentración en suero mejorado en el tiempo (AUC) y una vida media de eliminación prolongada por encima de la de un anticuerpo anti-VAP-1 quimérico denominado BTT-1002.

Anticuerpos monoclonales anti-VAP-1 completamente humanos Campo de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal completamente humano, denominado BTT- 123, que reconoce un epítopo funcional de la proteína de adherencia celular endotelial humana VAP-1.

Antecedentes de la invención

Generalmente, los anticuerpos completos comparten una estructura en Y común compuesta por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Estas cuatro subunidades polipeptídicas se ensamblan de manera que las dos cadenas pesadas están unidas, y una cadena ligera está anclada a cada cadena pesada por medio de enlaces disulfuro. Cada polipéptido que constituye el anticuerpo consiste en una región variable y una constante.

La región variable está localizada en los brazos del anticuerpo en forma de Y, y determina la especificidad de unión al antígeno del anticuerpo. Esta región contiene secuencias de aminoácidos cortas, que son responsables de la unión del anticuerpo a su antígeno. Estas regiones se denominan regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Las partes restantes de las regiones variables son importantes para la conformación del bolsillo de unión al antígeno en su totalidad.

La región constante de un anticuerpo está localizada en la base de las cadenas pesadas, y determina la capacidad del anticuerpo para activar las reacciones inmunitarias a través de interacciones con receptores específicos. Estas regiones están generalmente muy conservadas, y la variabilidad está limitada a cinco isoformas básicas, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.

La proteína de adherencia vascular 1 (VAP-1) es una molécula de adherencia, inducible por inflamación, no clásica expresada sobre células endoteliales vasculares, donde media el rodamiento de leucocitos bajo condiciones de cizalla fisiológica. En este papel contribuye a la re-circulación de los linfocitos a través de vénulas endoteliales altas (HEV) de tejido linfoide secundario como parte del proceso normal de vigilancia inmunitaria.

No obstante, en condiciones inflamatorias, VAP-1 promueve la infiltración de leucocitos a tejido inflamado, contribuyendo de ese modo, y manteniendo, la respuesta inflamatoria. Esta infiltración puede a su vez estar perjudicando en enfermedades inflamatorias crónicas tales como artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis y muchas enfermedades autoinmunitarias y otras enfermedades inflamatorias. En otros entornos, la infiltración masiva de células proinflamatorias en el tejido después de un deterioro tisular grave resultante de infarto de miocardio, ictus y otras enfermedades, contribuye a la destrucción del tejido observada en estas respuestas inflamatorias agudas. Es probable que la reducción de la infiltración de células a los sitios de inflamación evitando la función de VAP-1 con anticuerpos bloqueadores permita resolver la inflamación y conducir a una mejora en los síntomas clínicos de estas enfermedades.

La Patente de los Estados Unidos 55878 describe un anticuerpo monoclonal (mAb), 1 B2, que reconoce VAP-1 y que puede bloquear la unión de los linfocitos a HEV tonsilar en un análisis de sección congelada. El mAb 1 B2 es un anticuerpo IgM murino y es específico para VAP-1.

El uso de mAb murinos como agentes terapéuticos tiene un potencial limitado, puesto que el sistema inmunitario humano reconoce los anticuerpos murinos como material foráneo y produce anticuerpos humanos antiratón (HAMA) para aclararlos del organismo. Esta reacción inmunitaria es una limitación principal para el uso de anticuerpos murinos en la terapia a largo plazo cuando se necesitan administraciones repetidas. El uso de anticuerpos anti-VAP-1 murinos en la medicina clínica podría estar limitado a pacientes tratados con inmunosupresores, y por lo tanto menos propensos a reacciones HAM, y a regímenes de tratamiento, en los que solamente es factible una única administración de los anticuerpos, tal como una lesión por isquemia-reperfusión en un infarto agudo o síndrome de dificultad respiratoria aguda.

Una desventaja adicional relacionada con el uso de anticuerpos anti-VAP-1 IgM murinos en terapia es el perfil cinético desfavorable de tales anticuerpos, esto es, la corta vida media, que los hace inadecuados para su uso en trastornos crónicos, tales como artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis y muchas otras enfermedades.

Se conocen en la técnica diversos métodos de creación de anticuerpos monoclonales menos inmunogénicos. Los enfoques preferidos incluyen "humanizar" los anticuerpos. Las estrategias utilizadas frecuentemente consisten en crear mAb quiméricos, mAb humanizados o mAb completamente humanos. Los mAb quiméricos son anticuerpos en los que la región variable deriva de ratón mientras la región constante es de origen humano. En los anticuerpos quiméricos, aproximadamente 7% de la molécula de anticuerpo de roedor es normalmente remplazado por las correspondientes secuencias humanas a la vez que mantienen los sitios de unión

al antígeno de roedor con sus particulares especificidades y afinidades. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos en donde la región variable puede ser derivada de roedor pero que ha sido mutada con el fin de que se asemeje más a un anticuerpo humano y puede contener una región constante de origen humano. Los anticuerpos completamente humanos son anticuerpos en donde tanto la región variable como la región constante son de origen humano.

La publicación de patente internacional WO 3/93319 describe un anticuerpo monoclonal anti-VAP-1 quimérico BTT-12, que tiene el potencial de presentar una inmunogenicidad reducida en comparación con los correspondientes anticuerpos murinos. No obstante, al ser un anticuerpo quimérico, BTT-12 todavía tiene secuencias de proteína correspondientes a las regiones variables del anticuerpo del que derivan directamente y sin modificación del anticuerpo de ratón original. Este anticuerpo todavía puede ser reconocido como foráneo y ser inmunogénico cuando se administra al ser humano. Sus propiedades farmacológicas, tales como su vida media de eliminación y sus propiedades funcionales, también pueden resultar comprometidas debido a su inmunogenicidad y a la producción de anticuerpos resultante contra él.

Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano con una inmunogenicidad reducida y mejores propiedades farmacológicas.

Breve descripción de la invención

La presente invención está ampliamente dirigida a anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos, a los métodos para producir tales anticuerpos y a los usos de los anticuerpos.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal anti-VAP-1 completamente humano o un fragmento de unión a VAP-1 del mismo mostrado en la reivindicación 1. Otro objeto de la presente invención hace referencia al uso del presente anticuerpo en diagnósticos in vivo o in vitro y/o en terapia. El presente anticuerpo tiene un potencial reducido para provocar una respuesta inmunitaria en los pacientes y tiene un perfil farmacológico favorable para fines terapéuticos.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar vectores de expresión y células anfitrionas que incorporan ácidos nucleicos que codifican el presente anticuerpo, para la expresión recombinante de anticuerpos anti-VAP-1.

Otra realización de la presente invención está dirigida a métodos para producir los anticuerpos anti-VAP-1 completamente humanos de acuerdo con la presente invención por medio de métodos de producción recombinante.

También se describen las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos y los usos terapéuticos de los mismos.

Breve descripción de las figuras

A continuación se describirá la invención con mayor detalle por medio de realizaciones preferidas con referencia a las figuras adjuntas, en las que

Las Figuras 1 a 5 muestran las secuencias de nucleótidos y las correspondientes secuencias de aminoácidos de las regiones variables de los anticuerpos anti-VAP-1 8C1 (Figura 1A-B), 8A4 (Figura 2A-B), 3F1 (Figura 3A-B), 5F12 (Figura 4A-B), y 4B3 (Figura 5A-B). Las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera variable (VL) (A) y la cadena pesada variable (VH) (B) se dedujeron de los ADNc clonados. Las tres CDR de cada cadena de aminoácidos se muestran en negrita con las correspondientes secuencias de nucleótidos subrayadas.

La Figura 6 muestra un alineamiento de la secuencia de proteínas de las regiones variables de la cadena pesada VH de 8C1, 8A4, 3F1, 5F12, y 4B3 que muestra la secuencia consenso (Fig. 6A). Se muestra un alineamiento de las CDR... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo anti-VAP-1 o un fragmento de unión a VAP-1 del mismo, caracterizado porque es completamente humano y comprende un polipéptido de la cadena pesada representado en el SEQ ID NO: 47 o su variante de secuencia conservativa, y un polipéptido de la cadena ligera representado en el SEQ ID NO: 48 o su variante de secuencia conservativa;

en donde el anticuerpo anti-VAP-1 o un fragmento de unión a VAP-1 del mismo muestran un perfil de concentración en suero mejorado en el tiempo (AUC) y una vida media de eliminación prolongada por encima de la de un anticuerpo anti-VAP-1 quimérico denominado BTT-12.

2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho fragmento de anticuerpo es un Fab, Fab', F(ab')2, Fv o Fv de cadena sencilla.

3. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo recombinante.

4. Un vector de expresión que codifica el anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de ácido nucleico representada en el SEQ ID NO 89, o su variante de secuencia conservativa, o una secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO 9, o su variante de secuencia conservativa.

5. Una célula anfitriona o un organismo no humano que comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Un método para producir un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano, que comprende las etapas de

a) transformar una célula anfitriona adecuada con al menos un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4,

b) cultivar dicho anfitrión en condiciones que favorecen la expresión, y

c) purificar los anticuerpos completamente humanos ensamblados a partir del medio de cultivo.

7. Un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso como medicamento o para su uso in vivo como agente de diagnóstico.

8. Un método de diagnóstico in vitro que comprende un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

9. El uso de un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno inflamatorio mediado por VAP-1 seleccionado del grupo que consiste en artritis y enfermedades del tejido conectivo, enfermedades inflamatorias intestinales, dermatosis, esclerosis múltiple, neuropatía inflamatoria, miopatía inflamatoria, encefalomielitis diseminada aguda, vasculitis del sistema nervioso central, síndrome de Sjogren, diabetes, lupus eritematoso generalizado, asma, enfermedad inflamatoria del hígado, enfermedad de Graves y ti roiditis.

1. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-VAP-1 completamente humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

11. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 para el tratamiento o el diagnóstico de un trastorno inflamatorio mediado por VAP-1 seleccionado del grupo que consiste en artritis y enfermedades del tejido conectivo, enfermedades inflamatorias intestinales, dermatosis, esclerosis múltiple, neuropatía inflamatoria, miopatía inflamatoria, encefalomielitis diseminada aguda, vasculitis del sistema nervioso central, síndrome de Sjogren, diabetes, lupus eritematoso generalizado, asma, enfermedad inflamatoria del hígado, enfermedad de Graves y tiroiditis.

12. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dichas artritis y enfermedades del tejido conectivo se seleccionan del grupo que consiste en artropatías reactivas, artropatías postinfecciosas, poliartropatías inflamatorias, trastornos sistémicos del tejido conectivo, espondiloartropatías inflamatorias, miositis, sinovitis, enfermedad de Reiter, artritis reumatoide seropositiva, artritis reumatoide, enfermedad reumatoide extraarticular, artropatías psoriásicas y enteropáticas, artritis juvenil, artritis, poliarteritis nodosa y afecciones relacionadas, vasculopatías necrotizantes, dermatopolimiositis, esclerosis sistémica, implicación sistémica del tejido conectivo, espondilitis anquilosante y espondilopatías inflamatorias.

13. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicha enfermedad intestinal inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.

14. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dichas dermatosis se seleccionan del grupo que consiste en trastornos hulosos, dermatitis, trastornos papuloescuamosos, eritema, liquen escleroso y atrófico, craurosis vulvar, lupus eritematoso discoide, morfea, pénfigo, penfigoide, dermatitis herpetiforme, dermatitis atópica, dermatitis de contacto alérgica, dermatitis de contacto irritante, dermatitis de

contacto, psoriasis, eritema multiforme.

15. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho trastorno inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en aterosclerosis, inflamación del ojo incuyendo uveitis, iritis, iridociclitis, hepatitis alcohólica, transplante con aloinjerto, transplante con xenoinjerto, glomerulonefritis, lesión por reperfusión y afecciones inflamatorias agudas después de infarto de miocardio e ¡ctus.