Proteína de adhesión vascular 1 humana cristalina (VAP-1), en la que dicho cristal se define como un cristal del grupo espacial P6522 con dos moléculas en la unidad asimétrica y con dimensiones unitarias de a = b = 225,

9 Å c = 218,7 Å a = b = 90º; g = 120º

VAP-1 cristalina y sus usos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la proteína de adhesión vascular 1 (VAP-1) humana cristalina y, en particular, al uso de información estructural de la VAP-1 humana cristalina para la identificación, el diseño y la producción de ligandos y/o inhibidores, así como para el análisis de rastreo in silico e in vitro de tales ligandos y/o inhibidores.

Antecedentes de la invención

La vigilancia inmune fisiológica depende del patrullaje continuo de los linfocitos entre la sangre y los diferentes órganos linfoides. En el tejido no linfoide normal, los linfocitos están ausentes o sólo se encuentran presentes a un nivel muy bajo, pero en muchos estados patológicos inflamatorios se pueden acumular enormes cantidades de linfocitos en diversos tejidos y órganos afectados. Una de las moléculas importantes que controlan la salida de los linfocitos de la sangre es la proteína de adhesión vascular 1 (VAP-1) revelada en la patente estadounidense n.º 5.580.780. La VAP-1 es una glucoproteína endotelial de 170-180 kDa homodimérica. La VAP-1 media la unión de los linfocitos con las vénulas de secciones de tejido humano. La VAP-1 está muy glicosilada y los restos de azúcar son importantes para la función de adhesión (Salmi et al., 1996). El bloqueo de la función de adhesión de la VAP-1 reduce el número de células que se infiltran en tejido inflamado permitiendo que baje la inflamación. La VAP-1 es, por tanto, una diana para el desarrollo de fármacos anti-inflamatorios.

La proteína de adhesión vascular 1 (VAP-1) humana es una glicoproteína multifuncional unida a la membrana con propiedades tanto adhesivas como enzimáticas. La clonación de la VAP-1 reveló que, sorprendentemente, pertenece a las monoamino-oxidasas sensibles a las semicarbazidas (SSAO; ec 1.4.3.6) (publicación de patente internacional WO 98/53049). La VAP-1 es una proteína integral de membrana de tipo 2 con un gran dominio extracelular catalíticamente activo. Por tanto, la VAP-1 es una ectoenzima. No están bien definidos ni el papel de la actividad SSAO ni sus sustratos fisiológicos en la interacción leucocito-endotelio. La VAP-1 fue el primer miembro de la transmembrana molecularmente definido de este grupo de enzimas en mamíferos, y representa el 90% de la actividad SSAO celular. Particularmente, las SSAO se diferencian de las mono-oxidasas A y B bien caracterizadas con respecto a la ubicación subcelular, los sustratos, los cofactores, los inhibidores y la secuencia de proteínas.

Aunque la reacción de las SSAO se conoce desde los años 50 del siglo XX en términos bioquímicos, la(s) fun- ción(es) fisiológica(s) de estas enzimas siguen siendo un enigma. Se desconocen los sustratos fisiológicos de las SSAO. Sin embargo, hay dos posibles candidatas, la metilamina y la aminoacetona, que se forman durante el metabolismo intermedio en seres humanos y que pueden ser desaminadas mediante SSAO in vitro e in vivo.

Se ha propuesto que la actividad SSAO de la VAP-1 está implicada directamente en la ruta de la adhesión de los leucocitos a las células endoteliales mediante un nuevo mecanismo que implica la interacción directa con un sustrato de amina presentado en un ligando de la VAP-1 expresado sobre la superficie de un leucocito (Salmi et al., 2001). Esta publicación describe la implicación directa de la actividad SSAO de la VAP-1 en el procedimiento de adhesión de leucocitos al endotelio. Por tanto, cabría esperar que los inhibidores de la actividad SSAO de la VAP-1 reduzcan la adhesión de los leucocitos en zonas de inflamación, reduciendo así el tráfico de leucocitos hacia la región inflamada y, por tanto, el propio proceso inflamatorio.

En muestras de tejido clínicas humanas, se induce la expresión de la VAP-1 en zonas de inflamación. Este aumento del nivel de la VAP-1 puede conducir a una mayor producción de H₂O₂ generada a partir de la acción del dominio extracelular de SSAO de la VAP-1 sobre las monoaminas presentes en la sangre. Esta generación de H₂O₂ en el medio localizado de la célula endotelial podría inicial otros eventos celulares. H₂O₂ es una molécula de señalización conocida que puede sobre-regular otras moléculas de adhesión y esta mayor expresión de moléculas de adhesión puede conducir a un mayor tráfico de leucocitos en las zonas en las que se expresa VAP-1. Otros productos de la reacción SSAO de la VAP-1 también pueden tener efectos biológicos que contribuyen al proceso inflamatorio. Por tanto, los productos de la actividad SSAO de la VAP-1 pueden estar implicados en una intensificación del proceso inflamatorio, que podría ser bloqueada por inhibidores específicos de la actividad SSAO.

La SSAO de la VAP-1 puede estar implicada en un número de otras afecciones patológicas asociadas con un aumento del nivel de sustratos de amina en circulación de SSAO de la VAP-1. La desaminación oxidativa de estos sustratos conduciría a un aumento del nivel de aldehídos tóxicos y radicales de oxígeno en el medio local la célula endotelial que podría dañar las células conduciendo a una lesión vascular. Se han publicado aumentos de los niveles de metilamina y aminoacetona en pacientes con diabetes de tipo I y de tipo II, y se ha propuesto que las vasculopatías tales como la retinopatía, la neuropatía y la nefropatía observadas en estadios tardíos de la diabetes podrían ser tratadas con inhibidores específicos de la actividad SSAO.

El desarrollo de inhibidores específicos de la actividad SSAO de la VAP-1 que modulen la actividad de la VAP-1 serían útiles para el tratamiento de afecciones o enfermedades inflamatorias agudas o crónicas, tales como la artritis crónica, las enfermedades inflamatorias del intestino y dermatosis cutáneas, así como las enfermedades relacionadas con el metabolismo de los hidratos de carbono (incluyendo la diabetes y las complicaciones que resultan de la diabetes, tales como las vasculopatías). Además, las anomalías en la diferenciación o la función de adipocitos o en la función de las células del músculo liso (en concreto, la aterosclerosis) y diversas enfermedades vasculares pueden ser adecuadas para el tratamiento con inhibidores de la SSAO de la VAP-1.

La publicación de patente internacional WO 03/006003 da a conocer compuestos de hidrazina carbocíclicos, así como su uso como inhibidores de las amino-oxidasas sensibles a semicarbazidas (SSAO), incluyendo la proteína de adhesión vascular 1 (VAP-1) humana.

Las amino-oxidasas que contienen cobre (CAO; EC 1.4.3.6) pertenecen a la superfamilia funcionalmente diversa de amino-oxidasas (Dawkes et al., 2001). También se conocen como amino-oxidasas sensibles a semicarbazidas, pues su actividad enzimática puede ser bloqueada por un compuesto reactivo al carbonilo, la semicarbazida. Catalizan la desaminación oxidativa de las aminas primarias en los correspondientes aldehídos en una reacción dependiente del cobre en la que se consume oxígeno molecular y se libera peróxido de hidrógeno y amoníaco. Un rasgo característico de todas las CAO es el uso de 2,4,5- trihidroxifenilalanin-quinona, una topaquinona (TPQ), como cofactor rédox. Las CAO han sido aisladas de varios organismos diferentes, incluyendo bacterias, hongos, plantas y mamíferos. En las plantas, las CAO están implicadas, p. ej., en la cicatrización de heridas, mientras que en procariotas, las CAO permiten que el organismo utilice diversas aminas metabólicamente como fuentes de nitrógeno y carbono. En eucariotas superiores, se conoce muy poco acerca de la función biológica de las CAO aparte de su papel en el metabolismo de aminas biogénicas y otras aminas.

Shepard et al., 2002, comunicaron sorprendentes diferencias en la selectividad y en las tasas de desactivación al probar inhibidores frente a seis amino-oxidasas que contenían cobre.

Se han resuelto las estructuras cristalinas de las CAO de cuatro especies diferentes: Escherichia coli (ECAO; p. ej., Banco de Datos de Proteínas, código PDB 1oac) (Parsons et al., 1995), Pisum sativum (PSAO; código PDB 1 ksi) (Kumar et al., 1996), Hansenula polymorpha (HPAO; p.ej., código PDB la2v) (Li et al., 1998) y Arthobacter globiformis (AGAO; p.ej. código PDB 1av4) (Wilce et al., 1997). Todas estas estructuras homodiméricas tienen un plegamiento global similar que se puede dividir en dominios D1-D4, de los cuales el dominio D1 sólo se encuentra en E. coli. Los dominios D2 y D3 son de ~100 aminoácidos cada uno y tienen...

1. Proteína de adhesión vascular 1 humana cristalina (VAP-1), en la que dicho cristal se define como un cristal del grupo espacial P6522 con dos moléculas en la unidad asimétrica y con dimensiones unitarias de a = b = 225,9 ring{A}; c = 218,7 ring{A}; a = b = 90º; g = 120º.

2. La VAP-1 cristalina según la reivindicación 1, que comprende dominios D2, D3 y D4, que se caracteriza por las secuencias de aminoácidos SEC ID N.º 3, SEC ID N.º 4 y SEC ID N.º 5, respectivamente.

3. La proteína VAP-1 cristalina según la reivindicación 2, que comprende una cavidad de sitio activo con una anchura de ~20 ring{A} x ~10 ring{A} en la superficie y una profundidad de ~15 ring{A}.

4. La proteína VAP-1 cristalina según la reivindicación 3, en la que dicha cavidad de sitio activo comprende los aminoácidos 86-87, 97, 168-173, 176-177, 180, 184, 205-212, 216, 227, 232-234, 236-239, 344, 388-390, 393-397, 415-419, 421, 421-426, 467-470, 647-651 y 758-761 de SEC ID N.º 2 de un monómero, y los aminoácidos 443-449 y 451 de SEC ID N.º 2 del otro monómero de la VAP-1 humana.

5. La proteína VAP-1 cristalina según la reivindicación 4, en la que dicho sitio activo comprende además el aminoácido Leu469 encima de una cavidad estrecha de ~4,5 ring{A} x -4,5 ring{A} en la parte inferior de dicha cavidad.

6. La proteína VAP-1 cristalina según la reivindicación 5, en la que dicha parte inferior de la cavidad del sitio activo está revestida por los residuos de aminoácido Ala370, Tyr384, Asp386, Asn470, Tpq471 y Tyr473.

7. Una composición que comprende una VAP-1 cristalina según cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. Un procedimiento para cristalizar VAP-1 humana, que comprende las etapas de:

9. Un procedimiento para identificar un compuesto que interactúa con la proteína VAP-1 humana, que comprende las etapas de: a) proporcionar coordenadas atómicas de dicha proteína en un soporte informático de lectura que tenga almacenado datos de coordenadas atómicas/difracción de rayos X que definan la estructura tridimensional de la proteína VAP-1 humana, capaces de mostrar una representación tridimensional de un cristal de una molécula que comprende un fragmento de proteína VAP-1 humana cuando son leídas por una máquina apropiada y procesadas por un programa informático para determinar estructuras moleculares, definiendo dichos datos la cavidad del sitio activo de la proteína VAP-1 humana dimérica y teniendo dicha cavidad del sitio activo una anchura de ~20 ring{A} x -10 ring{A} en la superficie y una profundidad de ~15 ring{A}, y que comprende además el aminoácido Leu469 encima de una cavidad estrecha de -4,5 x -4,5 en la parte inferior del sitio y b) usando un ordenador para aplicar técnicas de modelización molecular a dichas coordenadas.

10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicha cavidad del sitio activo comprende los aminoácidos 86-87, 97, 168-173, 176-177, 180, 184, 205-212, 216, 227, 232- 234, 236-239, 344, 388-390, 393-397, 415-419, 421, 421-426, 467-470, 647-651 y 758-761 de un monómero, y los aminoácidos 443-449 y 451 del otro monómero de la VAP-1 humana.

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha parte inferior de la cavidad del sitio activo está revestida por los residuos de aminoácido Ala370, Tyr384, Asp386, Asn470, Tpq471 y Tyr473.

12. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que dichas técnicas de modelización molecular implican el diseño de compuestos de novo.

13. El procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho diseño de compuestos de novo implica (i) la identificación de grupos funcionales o pequeños fragmentos moleculares que pueden interactuar con sitios del sitio activo de la VAP-1 y (ii) la unión de éstos en un sólo compuesto.

14. El procedimiento según la reivindicación 13, en el que las técnicas de modelización molecular usan un farmacóforo de la VAP-1.

15. El procedimiento según la reivindicación 14, en el que las técnicas de modelización molecular usan algoritmos de acoplamiento automáticos.

16. El procedimiento según la reivindicación 14 que comprende las etapas adicionales de (c) proporcionar un compuesto identificado mediante dichas técnicas de modelización molecular; y (d) poner en contacto dicho compuesto con la VAP-1 humana y detectar el efecto inhibidor de dicho compuesto sobre la actividad SSAO de la VAP-1.