Anticuerpo dirigido contra el receptor EP4 de la prostaglandina E2 humano.

Un anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo, cada uno de los cuales se une al dominio extracelular de un receptor de PGE2 del subtipo EP4 e inhibe la función de dicho receptor EP4 de PGE2 de aumento del nivel intracelular de AMPc.

Anticuerpo dirigido contra el receptor EP4 de la prostaglandina E2 humano.

Campo técnico [0001] La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal dirigido contra un receptor de la prostaglandina E2 humano del subtipo EP4.

Técnica anterior

Las prostaglandinas (PG) , al igual que los tromboxanos, son sustancias fisiológicamente activas conocidas como “prostanoides” y son lípidos con un esqueleto de ácido prostanoico. Los prostanoides tales como las prostaglandinas se sintetizan a partir del ácido araquidónico que se produce a partir de un fosfolípido de la membrana por la acción de la fosfolipasa A2. Las prostaglandinas se clasifican en los grupos A a J, sobre la base de diferencias en el tipo de átomo de oxígeno unido al anillo de cinco miembros de las mismas y un enlace doble. Además, las prostaglandinas se clasifica en los grupos 1 a 3 según el número de enlaces dobles en la cadena lateral del esqueleto de ácido prostanoico. Por ejemplo, la prostaglandina E (PGE) incluye PGE1, PGE2 y PGE3, que se diferencian entre sí en el número de enlaces dobles en la cadena lateral del esqueleto de ácido prostanoico.

Con respecto a las PG, PGH2 se genera a partir de PGG2, que se biosintetiza a partir del ácido araquidónico por la acción de la ciclooxigenasa I (COX-I) o la ciclooxigenasa II (COX-II) y después, PGD2, PGE2, PGF2α y similares se generan por diferencias en la escisión del enlace entre los átomos de oxígeno. A continuación, PGA2, PGC2 y similares se generan a partir de PGE2. Cada reacción de generación de PG tiene lugar por la acción de una enzima específica y se considera que tal enzima es específica del tejido y genera una PG adecuada para la función de cada tejido.

Entre las diversas PG, se considera que PGE desempeña diversas actividades biológicas importantes y que, a través de la mediación de su receptor específico, PGE está asociada con la regulación del sistema inmunitario, así como la vasodilatación, la disminución de la presión sanguínea y la contracción uterina. El receptor de PGE2 es un receptor con siete dominios transmembranales acoplado a la proteína G, al igual que otros receptores de PG. El receptor de PGE2 se abrevia como EP y se ha demostrado que EP tiene cuatro subtipos diferentes (EP1, EP2, EP3 y EP4) . Cada subtipo está asociado con diversos fenómenos in vivo. Esto es, EP1 está asociado con el aumento de la concentración intracelular de Ca2+, EP2 y EP4 están asociados con un aumento del

nivel de AMPc y EP3 está asociado con una disminución del nivel de AMPc (documento no de patente 1) . Los cuatro subtipos tienen gran homología entre sí en cuanto a su estructura proteínica.

Se ha descrito que cuando se administra un compuesto antagonista de bajo peso molecular con alta selectividad para EP4 a ratones inducidos para presentar encefalomielitis autoinmunitaria experimental o hipersensibilidad de contacto, se reduce la acumulación de las células TH1 y TH17 en los ganglios linfáticos regionales y se suprime la progresión de la enfermedad (documento no de patente 2) . Se ha demostrado que PGE2 estimula la producción de IL-23 en las células dendríticas como resultado de un aumento del nivel de AMPc mediado por la activación de EP4. Además, también se ha demostrado que, en las células TH17, PGE2 está implicada en la proliferación de las células TH17 en coordinación con IL-23. Por lo tanto, se ha demostrado que un aumento del

nivel de AMPc mediado por la activación de EP4 desempeña un papel importante en la señalización intracelular en las células TH17 (documento no de patente 3) . Estas publicaciones sugieren que el antagonista del receptor de PGE2, en particular un antagonista selectivo para EP4, sería eficaz para el tratamiento de enfermedades causadas por una anormalidad inmunitaria con la que estén asociadas las células TH1 o TH17, tales como esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedades inflamatorias intestinales y dermatitis de contacto (documento no de patente 2) .

Se ha descrito que muchos tipos de células cancerosas expresan COX-II en exceso en comparación con las células normales. Además, también se ha descrito que PGE2 actúa sobre los tejidos cancerosos o tejidos alrededor de los tejidos cancerosos y que está implicada en la progresión del cáncer. Por ejemplo, se ha descrito que PGE2 está implicada en la infiltración de células de cáncer de mama inflamatorio resistente o células de cáncer

de pulmón en un tejido metastásico (documentos no de patente 4 y 5) . Adicionalmente, se sabe que PGE2 está asociada con la proliferación de las células de cáncer de pulmón no microcítico, las células de cáncer de colon, las células de cáncer de mama inflamatorio, los linfocitos B, las células de cáncer de próstata y el melanoma a través de EP4.

Se sabe que PGE2 inhibe la función de las células NK, cuya acción es atacar directamente a las células cancerosas. Uno de los mecanismos de PGE2 para inhibir la función de las células NK es un aumento del nivel intracelular de AMPc mediado por la activación de EP4 (documento no de patente 6) . También se sabe que las células Treg, que posiblemente suprimen la inmunidad al cáncer, se activan a través de EP4 y se ha sugerido la 5 posibilidad de una disminución del sistema inmunitario contra las células cancerosas in vivo (documento no de patente 7) . De acuerdo con estas publicaciones, es evidente que PGE2 es importante para la progresión del cáncer. Por consiguiente, se han llevado a cabo estudios clínicos con inhibidores no selectivos de la COX implicada en la generación de PGE2. Sin embargo, no han podido obtenerse resultados terapéuticos suficientes a causa de los efectos secundarios de los inhibidores. Un antagonista del receptor de PGE2, en particular un antagonista selectivo para EP4, suprime directamente la proliferación de las células cancerosas y refuerza el sistema inmunitario del hospedador contra el cáncer. En consecuencia, se anticipa que un anticuerpo que se una selectivamente al receptor EP4 será eficaz para el tratamiento de diversos tipos de cáncer, tales como cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de piel y linfoma B.

Convencionalmente, se han utilizado inhibidores inespecíficos de la COX para el alivio del dolor. Sin embargo, se sabe que tales inhibidores inespecíficos causan efectos secundarios tales como pirosis, indigestión, náusea, distensión abdominal, diarrea, gastralgia, úlcera péptica o hemorragia gastrointestinal. En los últimos años, se han desarrollado inhibidores selectivos de COX-II (por ejemplo, celecoxib y rofecoxib) para el tratamiento del dolor. Sin embargo, se ha sugerido que tales inhibidores selectivos de COX-II producen graves trastornos cardiovasculares en pacientes específicos y, por lo tanto, se desea desarrollar un fármaco para alivio del dolor con un modo de acción diferente. Entre las PG generadas por la COX, se sabe que PGE2 aumenta la hipersensibilidad a la sensación de dolor. En múltiples experimentos con animales se ha demostrado que, entre los receptores de PGE2, EP4 está especialmente asociado con el aumento de la hipersensibilidad a la sensación de dolor. Por ejemplo, se sabe que la expresión de EP4 aumenta en el ganglio radicular dorsal (GRG) en un modelo de dolor inflamatorio en rata y que un antagonista comparativamente selectivo para EP4 (AH23848) reduce la sensibilidad al dolor en el modelo mencionado anteriormente (documento no de patente 8) . Además, en un análisis en el que también se usaron ratones con EP4 inactivado pudieron obtenerse los mismos resultados (documento no de patente 9) . Estas publicaciones sugieren que un producto farmacéutico para bloquear selectivamente la función de EP4 sería eficaz para el tratamiento de enfermedades asociadas con una anormalidad inmunitaria, el cáncer y el dolor, y tendría menos efectos secundarios.

Como procedimientos para bloquear selectivamente la función de EP4, se han descrito varios compuestos antagonistas de bajo peso molecular. Sin embargo, ninguno de tales compuestos antagonistas ha tenido éxito como producto farmacéutico. Tales compuestos antagonistas de bajo peso molecular podrían mejorarse en cuanto a la selectividad de la unión a los subtipos de receptores de PGE2 (EP1-4) o a la reducción de la afinidad de unión a los receptores de tromboxano u otros prostanoides. Existe la preocupación de que se generen los mismos efectos secundarios que con los inhibidores de la COX, a menos que se asegure la suficiente selectividad para el receptor.

Se espera que un anticuerpo que se una selectivamente al receptor EP4 tenga mayor selectividad que los compuestos de bajo peso molecular. Además, dado... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo, cada uno de los cuales se une al

dominio extracelular de un receptor de PGE2 del subtipo EP4 e inhibe la función de dicho receptor EP4 de PGE2 de 5 aumento del nivel intracelular de AMPc.

2. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en que el anticuerpo está producido por hibridomas con los números de acceso de depósito internacional FERM BP-11402 (NBG016-mAb14) y FERM BP11403 (NBG016-mAb21) .

3. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en que el anticuerpo se une específicamente al dominio extracelular de EP4 y comprende uno cualquiera de los siguientes (A) , (B) , o (C) , con respecto a las secuencias aminoacídicas de sus regiones determinantes de complementariedad 1-3 (CDR1-3) :

(A) el anticuerpo tiene una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 5, una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 6,

una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 7, una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 8, una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 9 y una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 10;

(B) el anticuerpo tiene una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 15, una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 16,

una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 17, una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 18, una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 19 y una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO:

20;o (C) el anticuerpo tiene una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 45, una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO:

46, una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 47, una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 48, una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 49

y una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO:

50.

4. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en que el anticuerpo se une específicamente al dominio extracelular de EP4 y comprende uno 50 cualquiera de los siguientes (a) , (b) o (c) , con respecto a las secuencias aminoacídicas de la región variable de la cadena pesada y de la región variable de la cadena ligera:

(a) el anticuerpo tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 2 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 4;

(b) el anticuerpo tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 12 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 14;

(c) el anticuerpo tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 43 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO: 44.

5. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.

6. El anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, en que la región variable de la cadena pesada o la región variable de la cadena ligera de dicho anticuerpo o fragmento del mismo está codificada por un ácido nucleico según se muestra en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42.

7. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

8. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, para uso en un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad inmunitaria.

9. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, para uso en un procedimiento para el tratamiento de un tumor.

10. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7 para uso en un procedimiento para el tratamiento del dolor.

11. Un anticuerpo inmovilizado en un vehículo, en que el anticuerpo dirigido contra EP4 o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 está inmovilizado en un vehículo.

12. Un procedimiento para la eliminación de las células que expresan el receptor EP4 de PGE2 de la sangre, en el que un anticuerpo inmovilizado en un vehículo de acuerdo con la reivindicación 11 se pone en contacto ex vivo con sangre que contiene células que expresan EP4, con la subsiguiente eliminación de dichas células que expresan EP4 de dicha sangre.

13. Un kit para la medición del nivel de expresión del receptor EP4 de PGE2 en una superficie celular, que comprende el anticuerpo dirigido contra EP4 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.