Alteración dirigida de ADN.

Procedimiento para la alteración dirigida de una secuencia de ADN aceptor de doble cadena que comprende una primera secuencia de ADN y una segunda secuencia de ADN que es el complemento de la primera secuencia de ADN,

comprendiendo el procedimiento

combinar la secuencia de ADN aceptor de doble cadena con un oligonucleótido donante, en el que el oligonucleótido comprende al menos un dominio que es capaz de hibridarse a la primera secuencia de ADN, cuyo dominio comprende o está directamente adyacente a al menos un desapareamiento con respecto a la primera secuencia de ADN, y en el que dicho al menos un desapareamiento se encuentra como máximo 2 nucleótidos, preferiblemente como máximo 1 nucleótido del extremo 3' de dicho oligonucleótido, lo más preferiblemente dicho al menos un desapareamiento está en el extremo 3' del oligonucleótido, en el que el procedimiento no es para el tratamiento de un cuerpo humano o animal mediante terapia o para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/NL2011/050804.

Solicitante: KEYGENE N.V..

Nacionalidad solicitante: Países Bajos.

Dirección: P.O. BOX 216 6700 AE WAGENINGEN PAISES BAJOS.

Inventor/es: BUNDOCK,PAUL, LHUISSIER,FRANCK.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/10 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).

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Fragmento de la descripción:

Alteración dirigida de ADN Campo técnico

[0001] La presente invención se refiere a un procedimiento para la alteración dirigida de ADN aceptor, por ejemplo ADN aceptor de doble cadena. El procedimiento comprende el uso de un oligonucleótido que tiene un desapareamiento con respecto al ADN aceptor (doble cadena) dirigido. Este desapareamiento se encuentra en posiciones específicas en dicho oligonucleótido. También se proporciona un kit que comprende instrucciones para realizar el procedimiento según las invenciones, y en una realización preferida, comprende un oligonucleótido adecuado para su uso en el procedimiento.

Antecedentes de la invención

[0002] La modificación genética es el proceso de crear deliberadamente cambios en el material genético de células vivas. A menudo, el objetivo es modificar una propiedad biológica codificada genéticamente de esa célula, o del organismo del cual la célula forma parte o en el que se puede regenerar. Estos cambios pueden tomar la forma de eliminación de partes del material genético, la adición de material genético exógeno, o cambios en la secuencia de nucleótidos existente del material genético, por ejemplo mediante la sustitución de un nucleótido por otro.

[0003] Los procedimientos para la modificación genética de organismos eucariotas se conocen desde hace más de 20 años, y han encontrado una amplia aplicación en células vegetales, humanas y animales y microorganismos para mejoras en los campos de la agricultura, la salud humana, la calidad alimentaria y la protección del medio ambiente.

[0004] Una metodología de modificación genética común consiste en añadir fragmentos de ADN exógeno al genoma de una célula, que puede entonces conferir una nueva propiedad a esa célula u organismo sobre y por encima de las propiedades codificadas por genes ya existentes (incluyendo aplicaciones en las que la expresión de genes existentes será así suprimida).

[0005] Aunque estos procedimientos pueden tener cierta eficacia en proporcionar las propiedades deseadas a una diana, sin embargo, estos procedimientos no son muy precisos. No existe, por ejemplo, ningún control sobre las posiciones genómica en la que se insertan los fragmentos de ADN exógeno (y por tanto sobre los niveles últimos de expresión). Además, el efecto deseado tendrá que manifestarse por sí mismo sobre las propiedades naturales codificadas por el genoma original y bien equilibrado. Por el contrario, los procedimientos de modificación genética que darán lugar a la adición, deleción o conversión de nucleótidos en loci genómico predefinido permitirán la modificación precisa y controlable de genes existentes.

[0006] El intercambio seleccionado de nucleótidos dirigido por oligonucleótidos (TNE) es un procedimiento que se basa en la liberación en la célula eucariota de oligonucleótidos (sintéticos) (moléculas que constan de tramos cortos de nucleótidos y/o grupos de tipo nucleótido que se asemejan a ADN en sus propiedades de apareamiento de bases Watson-Crick, pero que pueden ser químicamente diferentes del ADN; (Alexeev y Yoon, 1998); (Rice et al, 2001); (Kmiec, 2003)).

[0007] Mediante el diseño deliberado de un nucleótido con un desapareamiento en la secuencia de homología del oligonucleótido, el nucleótido con un desapareamiento puede inducir cambios en la secuencia de ADN genómica a la que se puede hibridar el nucleótido. Este procedimiento permite la conversión de uno o más nucleótidos en la diana, y puede aplicarse, por ejemplo, para crear codones de parada en genes existentes, dando lugar a una perturbación de su función, o para crear cambios de codón, dando lugar a genes que codifican proteínas con composición de aminoácidos alterada (ingeniería de proteínas).

[0008] El intercambio seleccionado de nucleótidos (TNE) se ha descrito en muchos organismos, incluyendo plantas, animales y células de levadura y también se conoce como mutagénesis dirigida por oligonucleótidos (ODM).

[0009] Los primeros ejemplos de TNE que utilizaron oligonucleótidos quiméricos ADN:ARN provenían de células animales (revisado en (Igoucheva et al, 2001)). El TNE utilizando oligonucleótidos quiméricos ADN:ARN también se ha demostrado en células de plantas (Beetham et al, 1999; Kochevenko y Willmitzer, 2003; Okuzaki y Toriyama, 2004; Zhu et al, 2000; Zhu et al., 1999). En general, las frecuencias descritas en ambos estudios de plantas y animales eran demasiado bajas para la aplicación práctica de TNE en loci cromosómicos no seleccionares. El TNE utilizando oligonucleótidos quiméricos también se encontró que era difícil de reproducir (Ruiter et al., 2003), dando lugar a una búsqueda de diseños de oligonucleótidos alternativos que proporcionen resultados más fiables.

[0010] Varios laboratorios se han centrado en el uso de oligonucleótidos de cadena única (ss) para TNE. Se ha encontrado que éstos proporcionan resultados más reprodúceles tanto en células vegetales como animales (Liu et al., 2002) (Parekh-Olmedo et al., 2005) (Dong et al., 2006). Sin embargo, el mayor problema al que se enfrenta la aplicación de TNE en células de, en particular, los organismos superiores, tales como plantas, sigue siendo la baja eficacia relativa

que se ha descrito hasta el momento. En el maíz se ha descrito una frecuencia de conversión de 1 x 10" (Zhu et al., 2000). Estudios posteriores en el tabaco (Kochevenko y Willmitzer, 2003) y el arroz (Okuzaki y Toriyama, 2004) han descrito frecuencias de 1 x 10 s y 1 x 10", respectivamente.

[0011] El TNE utilizando diversos tipos de oligonucleótidos ha sido objeto de varias solicitudes de patentes y patentes, incluyendo US6936467, US7226785, US579597, US6136601, US2003/0163849, US2003/0236208, W003/013226, US5594121 y WO01/92512.

[0012] En US6936467 se contempla que la baja eficacia de la alteración del gen obtenida usando oligonucleótidos de ADN no modificado es el resultado de la degradación de los oligonucleótidos de los donantes por las nucleasas presentes en la mezcla de reacción o la célula diana. Se propone incorporar nucleótidos modificados que hacen que los oligonucleótidos resultantes sean (más) resistentes frente a las nucleasas. Estas modificaciones se describen que están situadas preferiblemente en los extremos del oligonucleótido, mientras que el desapareamiento está presente al menos a 8 nucleótidos de cada extremo terminal.

[0013] El documento US7226785 describe también procedimientos para alteraciones genómicas cromosómicas dirigidas utilizando oligonucleótidos monocatenarios modificados con al menos una región terminal resistente a nucleasa modificada. El TNE utilizando oligonucleótidos de cadena única modificados es también el objetivo de WO02/26967.

[0014] El documento W02010/017932 describe un oligonucleótido que comprende un nucleótido modificado entre 2-10 nucleótidos del extremo 3' del oligonucleótido, cuyo oligonucleótido se utiliza en un procedimiento de realización de una reacción de extensión con cebadores según el documento W02010/017932. Olsen et al. (2005, J, Gene Med. 7: 1534- 1544) describen que la síntesis de ADN está implicada en alteraciones genéticas específicas de sitio inducidas por oligonucleótidos de cadena única en células de mamífero seleccionadas.

[0015] Debido a la baja eficacia de los procedimientos actuales de TNE, sigue habiendo una necesidad de técnicas de TNE alternativas y/o mejores. Éstas pueden usarse solas o en combinación con técnicas de TNE existentes, tales como las descritas anteriormente y en la técnica, para mejorar la eficacia. En consecuencia, los presentes inventores pretenden mejorar la tecnología de TNE existente.

Descripción resumida de la Invención

Problema técnico

[0016] El problema técnico identificado en la técnica es que la metodología disponible actualmente para la introducción de cambios genéticos específicos y deseados en las células, por ejemplo para la introducción de cambios genéticos específicos en el genoma presente en una célula vegetal, se ve obstaculizada por la baja eficacia, haciendo que las técnicas sean laboriosas y costosas. Existe la necesidad de llegar a técnicas de TNE alternativas y mejores.

[0017] Por lo tanto, uno de los problemas a resolver es proporcionar un procedimiento alternativo y/o mejor y/o adicional para la introducción de un cambio o cambios genéticos en la información genética, en particular, en secuencias de ADN de doble cadena, tal como está presente en las células. Preferiblemente, dicho procedimiento tiene una eficacia mejorada en comparación con los descritos en la técnica. Dicho procedimiento permitiría la disposición de células con información genética alterada, más en... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento para la alteración dirigida de una secuencia de ADN aceptor de doble cadena que comprende una primera secuencia de ADN y una segunda secuencia de ADN que es el complemento de la primera secuencia de ADN, comprendiendo el procedimiento

combinar la secuencia de ADN aceptor de doble cadena con un oligonucleótldo donante, en el que el ollgonucleótldo comprende al menos un dominio que es capaz de ¡"¡¡bridarse a la primera secuencia de ADN, cuyo dominio comprende o está directamente adyacente a al menos un desapareamlento con respecto a la primera secuencia de ADN, y en el que dicho al menos un desapareamiento se encuentra como máximo 2 nucleótldos, preferiblemente como máximo 1 nucleótldo del extremo 3' de dicho oligonucleótido, lo más preferiblemente dicho al menos un desapareamlento está en el extremo 3' del oligonucleótido, en el que el procedimiento no es para el tratamiento de un cuerpo humano o animal mediante terapia o para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el nucleótido donante es complementario a la primera secuencia de ADN con la excepción de un apareamiento.

3. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el oligonucleótido comprende al menos una sección que contiene al menos un nucleótido modificado seleccionado del grupo que consiste en una modificación de bases, una modificación de bases en el extremo 3' y/o 5', una modificación del esqueleto o una modificación de azúcares.

4. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que el nucleótido modificado tiene una mayor afinidad de unión en comparación con nucleótidos A, C, T o G naturales con su nucleótido complementarlo, y en el que el nucleótido modificado se une más fuerte a un nucleótido en la posición opuesta en la primera secuencia de ADN en comparación con un nucleótido natural complementario al nucleótido en la posición opuesta en la primera secuencia de ADN y/o en el que el nucleótido modificado es un nucleótido resistente a nucleasa.

5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, en el que el nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste en LNA o nucleótidos que tienen enlaces fosforotioato.

6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el oligonucleótido comprende al menos dos, tres, cuatro o cinco nucleótidos modificados.

7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el desapareamiento no es un nucleótido modificado.

8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el nucleótido modificado es al menos un nucleótido de dicho al menos un desapareamiento situado como máximo 2 nucleótidos, preferiblemente como máximo 1 nucleótido del extremo 3' de dicho oligonucleótido, lo más preferiblemente dicho al menos un desapareamiento está en el extremo 3' del oligonucleótido.

9. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el oligonucleótido acomoda 2, 3 ó 4 desapareamientos.

10. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la alteración del ADN aceptor de doble cadena está en una célula, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en un célula procariota, una célula bacteriana, una célula eucariota, una célula vegetal, una célula animal, una célula de levadura, una célula fúngica, una célula de roedor, una célula humana, una célula no humana, y/o una célula embrionaria.

11. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ADN aceptor de doble cadena se obtiene de un organismo procariota, una bacteria, un organismo eucariota, una planta, un animal, una levadura, un hongo, un roedor o un humano.

12. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la alteración es una deleción, una sustitución y/o una inserción de al menos un nucleótido.

13. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ADN aceptor de doble cadena es de ADN genómico, ADN lineal, cromosomas artificiales de mamífero, cromosomas artificiales de bacterias, cromosomas artificiales de levadura, cromosomas artificiales de planta, ADN cromosómico nuclear, ADN de orgánulos, ADN plasmídico o ADN episomal.

14. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para alterar una célula, para corregir una mutación mediante la restauración al tipo salvaje, para inducir una mutación, para inactivar una enzima mediante la alteración de la región codificante, para modificar la bioactividad de una enzima mediante la alteración de la región codificante, para modificar una proteína mediante la alteración de la región codificante.

15. Procedimiento para la alteración dirigida de una secuencia de ADN aceptor de doble cadena que comprende una primera secuencia de ADN y una segunda secuencia de ADN que es el complemento de la primera secuencia de ADN, comprendiendo el procedimiento

combinar la secuencia de ADN aceptor de doble cadena con un oligonucleótldo donante, en el que el ollgonucleótldo comprende al menos un dominio que es capaz de hlbrldarse a la primera secuencia de ADN, cuyo dominio comprende o está directamente adyacente a al menos un desapareamlento con respecto a la primera secuencia de ADN, y en el que dicho al menos un desapareamiento se encuentra como máximo 2 nucleótidos, preferiblemente como máximo 1 nucleótido del extremo 3' de dicho oligonucleótldo, lo más preferiblemente dicho al menos un desapareamlento está en el extremo 3' del ollgonucleótido, en el que

el procedimiento se realiza ex vivo; y/o

la alteración de la secuencia de ADN aceptor de doble cadena está en una célula seleccionada del grupo que consiste en una célula procariota, una célula bacteriana, una célula vegetal, una célula de levadura y una célula fúnglca.

16. Utilización de un oligonucleótido, tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-14, para la alteración

dirigida de una secuencia de ADN aceptor de doble cadena, preferiblemente, para alterar una célula, corregir una mutación mediante la restauración al tipo salvaje, para inducir una mutación, para inactivar una enzima mediante la alteración de la reglón codificante, para modificar la bioactividad de una enzima mediante la alteración de la región codificante, para modificar una proteína mediante la alteración de la región codificante, reparación de

desapareamlentos, alteración dirigida de material genético (planta), incluyendo mutación de genes, reparación dirigida de genes y knockout de genes, en la que la utilización no es para el tratamiento de un cuerpo humano o animal mediante terapia o para modificar la Identidad genética de la línea germinal de seres humanos.

17. Utilización de un ollgonucleótido, tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-14, para la alteración

dirigida de una secuencia de ADN aceptor de doble cadena, preferiblemente, para alterar una célula, corregir una mutación mediante la restauración al tipo salvaje, para inducir una mutación, para inactivar una enzima mediante la alteración de la reglón codificante, para modificar la bioactividad de una enzima mediante la alteración de la región codificante, para modificar una protelna mediante la alteración de la región codificante, reparación de

desapareamlentos, alteración dirigida de material genético (planta), incluyendo mutación de genes, reparación dirigida de genes y knockout de genes, en la que

la utilización se realiza ex vivo; y/o

la alteración de la secuencia de ADN aceptor de doble cadena está en una célula seleccionada del grupo que consiste en una célula procariota, una célula bacteriana, una célula vegetal, una célula de levadura y una célula fúngica.


 

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