Farneseno sintasa.

Polinucleótido aislado según la SEQ ID NO: 1, o un polinucleótido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:

1, en el que dicho polinucleótido codifica un polipéptido con actividad de alfa-farneseno sintasa y actividad de beta-farneseno sintasa.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/NL2009/000244.

Solicitante: KEYGENE N.V..

Nacionalidad solicitante: Países Bajos.

Dirección: P.O. BOX 216 6700 AE WAGENINGEN PAISES BAJOS.

Inventor/es: DE BOTH,Michiel,Theodoor,Jan, SCHUURINK,ROBERT CORNELIS, AMENT,KAI, HARING,MICHAEL ALBERTUS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/60 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Liasas (4).
  • C12N15/82 C12N 15/00 […] › para células vegetales.
  • C12N9/88 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Liasas (4.).
  • C12P5/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 5/00 Preparación de hidrocarburos. › acíclicos.

PDF original: ES-2535722_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Farneseno sintasa Descripción resumida

[0001] Se aisló una nueva farneseno sintasa a partir de tomate. La farneseno sintasa muestra propiedades sorprendentes con respecto a los productos finales formados y su gen tiene, a nivel de nucleótidos, una identidad de secuencia baja con genes conocidos de farneseno sintasa de otros orígenes. La invención se refiere a polinucleótidos aislados, polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos, construcciones genéticas, vectores, huéspedes, en particular plantas, que albergan dichos polinucleótidos, polipéptidos y construcciones genéticas, y semillas derivadas de dichas plantas.

Campo técnico

[0002] La presente invención se refiere a una enzima farneseno sintasa, en particular a una alfa-farneseno sintasa y/o una beta-farneseno sintasa. También se refiere a secuencias de polinucleótidos que codifican dichas enzimas. La invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico (o genéticas), vectores y células huésped que incorporan las secuencias de polinucleótidos. Se refiere además a la producción de alfa-farneseno y/o beta-farneseno, y al uso de las mismas.

Antecedentes de ¡a técnica

[0003] El término farneseno se refiere a un conjunto de seis compuestos químicos estrechamente relacionados que son todos sesquiterpenos. El alfa-farneseno y el beta-farneseno son isómeros, que se diferencian por la localización de un doble enlace. El alfa-farneseno es 3,7,11-trimet¡l-1,3,6,10-dodecatetraeno y el beta-farneseno es 7,11-dimetil-3-met¡len-

I, 6,10-dodecatrleno. El alfa-farneseno puede existir como cuatro estereolsómeros que difieren en la geometría de dos de sus tres dobles enlaces Internos (los estereolsómeros del tercer doble enlace Interno son idénticos). El beta- farneseno existe como dos estereoisómeros en la geometría de su doble enlace central. Sólo hay un entendimiento limitado con respecto a las diferencias entre los diversos Isómeros de alfa-farneseno y beta-farneseno, en relación con la función específica de estos Isómeros.

[0004] El alfa-farneseno está constitutivamente presente o es inducido en una amplia gama de especies (Gapper et al, Postharvest Biology and Technology 42: (2006) 225-233). Se cree que el alfa-farneseno se sintetiza a partir de farnesil difosfato (FDP) en una reacción que procede a través de un intermedio carbocatión, y se describe que es catalizada por la enzima alfa-farneseno sintasa (Rupasinghe, et al., J. Am. Soc. Hortic. Sci. 123,882-886 (1998)). El beta-farneseno se produce en una amplia gama de taxones de plantas y animales. Se han publicado varios artículos sobre la presencia de este producto natural y su utilización como mensajero importante en la comunicación química. El beta-farneseno se encuentra en el aceite esencial de muchas especies de gimnospermas y angiospermas, incluyendo Chamomilla recutita, Vltis vinifera, Zea mays, y Piper nigrum. La (E)-beta-farneseno sintasa es inducida por la herbivoría del gusano de la hoja de algodón egipcio (Spodoptera littoralis) en la vaina de maíz y el tejido de la hoja, pero no en tejidos de la raíz (Schnee et al, Plant Physiol, 2002, 130: 2049 a 2060) Se cree que el beta-farneseno es sintetizado a partir de FDP, en una reacción que implica la ionización asistida por un ion de metal divalente del áster difosfato y la desprotonación de la C-3 de metilo del carbocatión resultante, tal como se describe en W01999/18118.

[0005] Entre sus funciones, el alfa-farneseno se describe como un atrayente de insectos y actúa como una feromona sexual en ratones e insectos. Actúa como una feromona de alarma en Prorhinotermes canalifrons (Sobotnik et al (2008)

J. Chem Ecol 34 (4): 478-86). Otros usos de alfa-farneseno y sus derivados son como potentes agentes de prevención del cáncer, y en la síntesis de películas de plástico (US20060137032). Hernández-ceruelos et al (Toxicol Lett 135: 103- 110, 2005) describe los efectos antlmutagénicos de [Tfarneseno, el principal componente del aceite esencial de manzanilla, en células de médula ósea de ratón después de los tratamientos mutagénicos.

[0006] El beta-farneseno se ha descrito como un componente principal del olor de polen en Lupinus y estimula el comportamiento de la polinización en abejorros (Dobson et al. (1996) Am. J. Bot. 83, 877-885). Más importante aún, se ha descrito el uso de beta-farneseno por especies de áfidos como una feromona de alarma, por ejemplo, para Aphis gossypii (pulgón del algodón) (Jianwei et al, 2006, J. Econ Entomol 99 (5): 1636-1640 ; Kislowy Edwards, 1972, Nature 235: 108-109; Plckett y Griffiths, 1980, J. Chem Ecol 6: 349-360 y para Myzus persicae (pulgón verde del melocotonero) (Edwards, LJ, 1973, Nature 241: 126-127). Los áfidos expuestos a beta-farneseno se vuelven inquietos y se dispersan de su planta huésped (Wohlers (1981) Z Angew. Entomol. 92, 329-336). El beta-farneseno es muy tóxico para los áfidos en una dosis de 100 ng/áfido (van Oosten et al. (1990) Acta Phytopathol. Entomol. Hung 25, 331-342). También de interés es el conocimiento de que el vapor de beta-farneseno es tóxico para las moscas blancas (Klijnstra et al. (1992) Meded Fac. Landbouwwet. 57, 485-491). Desafortunadamente, los esfuerzos por controlar el comportamiento de áfidos mediante aplicación tópica de beta-farneseno a los cultivos han tenido poco éxito, debido a la volatilidad y la inactivación oxidativa rápida en el aire (Dawson et al. (1988) Pest. Sci. 22, 17-30).

[0007] Schnee et al (Plant Physlology Vol. 130, pág. 2049 (2002) describe una terpeno slntasa que cataliza la formación de (E)-beta-farneseno. W02004/035791 describe una alfa-farneseno slntasa de Malus domestica. W099/18118 describe una (E)-beta farneseno slntasa de Mentha piperita.

[0008] Green et al (2007, Phytochemistry 68; 176-188) describe una farneseno slntasa de manzana que tiene actividad alfa- y beta-farneseno sintasa. W02004/035791A1 describe una alfa-farneseno sintasa aislada y secuencias de polinucleótidos que codifican la enzima.

Descripción resumida de ia invención

[0009] La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0010] En un primer aspecto, se proporciona un polinucleótido según la SEQ ID NO: 1, y homólogos del mismo. El nucleótido puede codificar un polipéptido con actividad de farneseno sintasa, en particular, la actividad de alfa-farneseno sintasa y/o la actividad de la beta-farneseno sintasa.

[0011] En un aspecto adicional, la invención proporciona un polipéptido según la SEQ. ID. NO: 2, y homólogos del mismo. El polipéptido puede tener actividad de farneseno sintasa, en particular, actividad de alfa-farneseno sintasa y/o actividad de beta-farneseno sintasa.

[0012] En todavía otro aspecto, la invención proporciona una construcción genética, un vector que comprende dicha construcción genética, y una célula huésped que comprende dicha construcción genética, en la que la construcción genética comprende un polinucleótido según la presente invención.

[0013] En todavía otro aspecto, la invención proporciona una planta transgénica o una célula de planta transgénica que comprende dicha construcción genética, y semillas derivadas de dichas plantas o células vegetales.

[0014] En todavía un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento para la preparación de alfa-farneseno y/o beta- farneseno que comprende el uso de un polinucleótido según la presente invención.

[0015] En todavía un aspecto adicional, se proporciona un procedimiento para la modulación de alfa-farneseno y/o la producción de beta-farneseno de una planta, que comprende la regulación del nivel de expresión de polipéptidos codificados por los polinucleótidos según la invención.

[0016] Los aspectos anteriores y otras ventajas de la presente invención serán más fácilmente entendidos, ya que los mismos se entienden mejor mediante referencia a la siguiente descripción detallada y ejemplos, cuando se toman en conjunto con los dibujos adjuntos, la descripción de los cuales se proporciona en el descripción y ejemplo.

Definiciones

[0017] En la siguiente descripción y ejemplos se utilizan varios términos. Con el fin de proporcionar una comprensión clara y consistente de la memoria y las reivindicaciones, incluyendo el alcance que debe darse a dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones. Salvo que se defina de otra manera en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención.

[0018] "Farneseno sintasa" se refiere a una enzima que es capaz de convertir difosfato de farnesilo en alfa-farneseno

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Reivindicaciones:

1. Polinucleótido aislado según la SEQ ID NO: 1, o un pollnucleótldo que tiene al menos un 70% de Identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, en el que dicho polinucleótido codifica un pollpéptido con actividad de alfa-farneseno sintasa y actividad de beta-farneseno slntasa.

2. Fragmento de un pollnucléotldo, según la reivindicación 1, en el que el fragmento codifica un polipéptldo con actividad de alfa-farneseno sintasa y actividad de beta-farneseno slntasa.

3. Polipéptido según la SEQ ID NO: 2, o un polipéptldo que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 2, en el que dicho polipéptldo tiene actividad de alfa-farneseno slntasa y actividad de beta-farneseno slntasa.

4. Fragmento de un polipéptldo, según la reivindicación 3, en el que el fragmento tiene actividad de alfa-farneseno y actividad de beta-farneseno slntasa.

5. Construcción genética que comprende un polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

6. Construcción genética que comprende en la dirección 5-3' un polinucleótido que en su marco de lectura abierto codifica un polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 3-4.

7. Construcción genética que comprende en la dirección 5-3' un polinucleótido que es complementario a un polinucleótido que codifica un polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 3-4.

8. Vector que comprende una construcción genética, según cualquiera de las reivindicaciones 5-7.

9. Célula huésped que comprende una construcción genética, según cualquiera de las reivindicaciones 5-7.

10. Planta o célula vegetal transgénlcas que comprende una construcción genética, según cualquiera de las

reivindicaciones 5-7.

11. Semillas derivadas de una planta o célula vegetal transgénica, según la reivindicación 10, que comprende una construcción genética, según cualquiera de las reivindicaciones 5-7.

12. Procedimiento de preparación de alfa-farneseno y beta-farneseno, que comprende las etapas de cultivar una célula que se ha modificado genéticamente con un polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para proporcionar una mayor actividad de alfa-farneseno sintasa y actividad de beta-farneseno sintasa; y, opcionalmente, proporcionar farnesil difosfato a la célula; y separar la alfa-farneseno y beta-farneseno producidas.

13. Procedimiento de modulación de la producción de alfa-farneseno y beta-farneseno de una planta, comprendiendo el procedimiento incrementar o disminuir la expresión de una alfa-farneseno sintasa y una beta-farneseno sintasa que tienen una secuencia de polipéptido, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3-4, en el que dicho incremento o disminución se consigue mediante la modificación genética para alterar la expresión de un polinucleótido que codifica dicho polipéptido.

14. Procedimiento de detección de la presencia o ausencia de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, en un tejido vegetal o muestra de ácido nucleico del mismo, que comprende:

a. Obtener una muestra de tejido vegetal o una muestra de ácido nucleico.

b. Analizar la muestra utilizando un ensayo de marcadores moleculares para la presencia o ausencia de uno o más marcadores unidos al polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, en el que el ensayo de marcadores detecta una secuencia según la SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1.

15. Utilización de un polinucleótido según la SEQ ID NO: 1, o un polinucleótido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 para mapear un marcador molecular (ADN) unido a la secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO: 1 o a una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido con actividad de alfa-farneseno sintasa y actividad de beta-farneseno sintasa.

16. Utilización de al menos 15 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1, o una secuencia que comprende al menos un 90% de identidad de nucleótidos con los mismos, como marcador molecular para un polinucleótido aislado según la

SEQ ID NO: 1, o para un polinucleótido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, en la que dicho polinucleótido codifica un polipéptido con actividad de alfa-farneseno sintasa y actividad de beta-farneseno sintasa o; como marcador para un polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, en la que dicho polipéptido tiene actividad de alfa-farneseno sintasa y actividad de beta-farneseno 5 sintasa.


 

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