Detección de alto rendimiento de marcadores moleculares basada en fragmentos de restricción.

Método para identificar la presencia o ausencia de fragmentos de restricción en una muestra,

que comprende las etapas de:

(a) proporcionar dos o más muestras de ácidos nucleicos;

(b) digerir cada muestra de ácido nucleico con al menos una endonucleasa de restricción para obtener un conjunto de fragmentos de restricción;

(c) proporcionar adaptadores sintéticos bicatenarios que comprenden

- una secuencia complementaria del cebador 5',

- una sección identificadora específica de la muestra,

- al menos un extremo

que se puede ligar al extremo romo o que sobresale de un fragmento de restricción;

(d) ligar los adaptadores sintéticos bicatenarios a los fragmentos de restricción en el conjunto, para proporcionar un conjunto de fragmentos de restricción ligados al adaptador;

(e) opcionalmente, amplificar el conjunto de fragmentos de restricción ligados al adaptador, con uno o más cebadores que son al menos complementarios a:

- la secuencia complementaria del cebador 5' del adaptador,

- la sección identificadora específica de la muestra del adaptador, y,

- opcionalmente, una sección del adaptador que es complementaria a los restos que sobresalen de la secuencia de reconocimiento de al menos una endonucleasa de restricción,

para proporcionar fragmentos de restricción ligados al adaptador amplificados (amplicones);

(f) determinar la secuencia de al menos la sección identificadora específica de la muestra, los restos de la secuencia de reconocimiento de al menos una endonucleasa de restricción y parte de la secuencia del fragmento de restricción situada adyacente a la secuencia derivada del adaptador o adyacente a los restos de la secuencia de reconocimiento de al menos una endonucleasa de restricción,

(g) comparar dos o más muestras para la presencia o ausencia de fragmentos de restricción ligados al adaptador;

(h) identificar la presencia o ausencia de fragmentos de restricción ligados al adaptador en la muestra.

Detección de alto rendimiento de marcadores moleculares basada en fragmentos de restricción Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la biología molecular y la biotecnología. En particular, la invención se refiere al campo de la identificación y detección de ácidos nucleicos. Más en particular, la invención se refiere a métodos para la detección y la identificación de marcadores, en particular marcadores moleculares. La invención se refiere a la provisión de métodos de alto rendimiento para la detección e identificación de marcadores moleculares. La invención también se refiere a la aplicación del método en la identificación de y/o detección de secuencias de nucleótidos que se relacionan con una gran diversidad de rasgos genéticos, genes, haplotipos y combinaciones de los mismos. La invención se puede usar en el campo de detección e identificación de alto rendimiento de marcadores moleculares de cualquier origen, ya sea vegetal, animal, humano, artificial o cualquier otro.

Antecedentes de la invención La comunidad científica, en particular la comunidad médica, ha deseado durante mucho tiempo la exploración del ADN genómico. El ADN genómico tiene la clave para la identificación, diagnóstico y tratamiento de enfermedades tales como el cáncer y la enfermedad de Alzheimer. Además de la identificación y el tratamiento de la enfermedad, la exploración del ADN genómico puede proporcionar ventajas significativas en los esfuerzos para reproducción de plantas y animales, que puede proporcionar respuestas a los problemas de alimentación y nutrición en el mundo.

Se sabe que muchas enfermedades están asociadas con componentes genéticos específicos, en particular con polimorfismos en genes específicos. La identificación de polimorfismos en muestras grandes tales como genomas es en la actualidad una tarea laboriosa y que consume mucho tiempo. Sin embargo, tal identificación es de gran valor en áreas tales como investigación biomédica, desarrollo de productos farmacéuticos, tipificación de tejidos, genotipificación y estudios de población.

Los marcadores, es decir, marcadores genéticos, se han usado durante mucho tiempo como un método de tipificación genética, es decir, para conectar un rasgo fenotípico con la presencia, ausencia o cantidad de una parte en particular del ADN (gen) . Una de las tecnologías de tipificación genética más versátiles es AFLP, desde hace ya muchos años y se puede aplicar ampliamente aplicable a cualquier organismo (para revisiones véase Savelkoul et al. J. Clin. Microbiol, 1999, 37 (10) , 3083-3091; Bensch et al. Molecular Ecology, 2005, 14, 2899-2914) .

La tecnología AFLP (Zabeau y Vos, 1993; Vos et al., 1995) ha encontrado un amplio uso en la reproducción de plantas y otros campos desde su invención en la década de los noventa. Esto se debe a varias características de AFLP, de las cuales la más importante es que no se necesita información de la secuencia para generar un gran número de marcadores genéticos de una manera reproducible. Además, el principio de amplificación selectiva, una piedra angular de AFLP, asegura que el número de fragmentos amplificados se puede poner de acuerdo con la resolución del sistema de detección, independientemente del tamaño o el origen del genoma.

La detección de fragmentos de AFLP se realiza normalmente por electroforesis en bloques de gel (Vos et al., 1995)

o por electroforesis capilar (van der Meulen et al., 2002) . La mayoría de los marcadores de AFLP puntuados de esta forma representan polimorfismos (de un solo nucleótido) que se producen en cualquiera de los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción usados para la preparación de molde de AFLP o sus nucleótidos de flanqueo cubiertos por cebadores de AFLP selectivos. El resto de los marcadores de AFLP son polimorfismos de inserción/supresión que se producen en las secuencias internas de los fragmentos de restricción y una fracción muy pequeña en sustituciones de un solo nucleótido que se producen en pequeños fragmentos de restricción (< aproximadamente 100 pb) , que para estos fragmentos causan variaciones de movilidad reproducibles entre ambos alelos que se pueden observar en la electroforesis; estos marcadores de AFLP se pueden puntuar de forma codominante sin tener que depender de las intensidades de banda.

En una identificación genética de AFLP habitual, los marcadores de AFLP constituyen por lo tanto la minoría de los fragmentos amplificados (menos de un 50 por ciento, pero a menudo menos de un 20 por ciento) , mientras que el resto se denomina normalmente fragmentos de AFLP constantes. Estos últimos, sin embargo, son útiles en el procedimiento de puntuación de gel ya que sirven como puntos de anclaje para calcular movilidades de fragmentos de marcadores de AFLP y ayudan en la cuantificación de los marcadores para la puntuación codominante. En la actualidad, la puntuación codominante (puntuación para homo o heterocigosidad) de marcadores de AFLP se limita al contexto de la identificación genética de una población segregada. En un panel de líneas no relacionadas, solamente es posible la puntuación dominante.

Aunque el rendimiento de AFLP es muy elevado debido a los niveles elevados de multiplexación en las etapas de amplificación y detección, la etapa limitante es el poder de resolución de la electroforesis. La electroforesis permite la identificación única de la mayoría de los fragmentos amplificados basándose en la combinación de combinaciones de enzimas de restricción (EC) , combinaciones de cebadores (PC) y movilidad, pero la electroforesis solamente es

capaz de distinguir los fragmentos amplificados basándose en las diferencias de movilidad. Los fragmentos de movilidad similar se encuentran a menudo como las llamadas bandas apiladas <[lambda]> y con electroforesis, con la electroforesis, no se puede proporcionar atención alguna a la información que se contiene en las denominadas bandas constantes, es decir, fragmentos de restricción amplificados que no parecen diferir entre especies comparadas. Además, en un sistema basado en gel habitual, o en un sistema de capilares tal como MegaBACE, las muestras se deben desarrollar en paralelo y solamente se pueden analizar de aproximadamente 100 a 150 bandas por calle en un gel o por capilaridad. Estas limitaciones también obstaculizan el rendimiento.

De forma ideal, el sistema de detección debería ser capaz de determinar toda la secuencia de los fragmentos amplificados para capturar todos los fragmentos de restricción amplificados. Sin embargo, la mayoría de las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento aún no pueden proporcionar lecturas de secuenciación que incluyen la totalidad de los fragmentos de AFLP, que por lo general tienen 100-500 pb de longitud.

Hasta ahora, la detección de marcadores/secuencias de AFLP mediante secuenciación no ha sido económicamente factible debido a, entre otras limitaciones, limitaciones del coste de la tecnología de secuenciación didesoxi de Sanger y otras tecnologías de secuenciación convencionales.

La detección mediante secuenciación en lugar de la determinación de la movilidad aumentará el rendimiento porque:

1) se detectarán polimorfismos localizados en las secuencias internas en la mayoría (o todos) los fragmentos amplificados; esto aumentará considerablemente el número de marcadores por PC. 2) No habrá pérdida de marcadores de AFLP debido a la comigración de marcadores de AFLP y bandas constantes. 3) La puntuación codominante no se basa en la cuantificación de las intensidades de banda y es independiente de la relación de los individuos identificados genéticamente.

Sin embargo, la detección por secuenciación de todo el fragmento de restricción todavía es relativamente poco económico. Por otra parte, la tecnología de secuenciación de última generación actual tal como se desde la en el presente documento en cualquier parte (de 454 Life Sciences, www.454.com y Solexa, www.solexa.com) , a pesar de su poder secuenciación abrumador, solamente puede proporcionar fragmentos de secuenciación de longitud limitada. Además, los métodos actuales no permiten el procesamiento simultáneo de muchas muestras en un desarrollo.

Van Eijk et al., presentaron un póster en la XIV Conferencia sobre Genomas de Plantas y Animales con el título "Complexity reduction of polimorphic sequences (Crops) : a novel approach for high throughput polymorphism discover y " [Online] enero de 2006. El póster desvela un método para el descubrimiento de SNP usando AFLP como un método para reducir la complejidad.

El documento de patente WO2006/137733 describe un método para la identificación de fragmentos de restricción... [Seguir leyendo]

1. Método para identificar la presencia o ausencia de fragmentos de restricción en una muestra, que comprende las etapas de: 5

(a) proporcionar dos o más muestras de ácidos nucleicos;

(b) digerir cada muestra de ácido nucleico con al menos una endonucleasa de restricción para obtener un conjunto de fragmentos de restricción;

(c) proporcionar adaptadores sintéticos bicatenarios que comprenden 10

- una secuencia complementaria del cebador 5, -una sección identificadora específica de la muestra, -al menos un extremo que se puede ligar al extremo romo o que sobresale de un fragmento de restricción;

(d) ligar los adaptadores sintéticos bicatenarios a los fragmentos de restricción en el conjunto, para proporcionar un conjunto de fragmentos de restricción ligados al adaptador;

(e) opcionalmente, amplificar el conjunto de fragmentos de restricción ligados al adaptador, con uno o más cebadores que son al menos complementarios a:

- la secuencia complementaria del cebador 5 del adaptador, -la sección identificadora específica de la muestra del adaptador, y, -opcionalmente, una sección del adaptador que es complementaria a los restos que sobresalen de la secuencia de reconocimiento de al menos una endonucleasa de restricción, para proporcionar fragmentos de restricción ligados al adaptador amplificados (amplicones) ;

(f) determinar la secuencia de al menos la sección identificadora específica de la muestra, los restos de la secuencia de reconocimiento de al menos una endonucleasa de restricción y parte de la secuencia del fragmento de restricción situada adyacente a la secuencia derivada del adaptador o adyacente a los restos de la secuencia de reconocimiento de al menos una endonucleasa de restricción, (g) comparar dos o más muestras para la presencia o ausencia de fragmentos de restricción ligados al adaptador;

(h) identificar la presencia o ausencia de fragmentos de restricción ligados al adaptador en la muestra.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los fragmentos de restricción son marcadores moleculares. 35

3. Método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que los marcadores moleculares son marcadores de AFLP.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dos o más muestras se combinan en un grupo después de la

etapa de ligación de los adaptadores. 40

5. Método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que, para cada muestra en el grupo, se usa un identificador específico de la muestra que se diferencia de los otros identificadores específicos de la muestra en el grupo.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los cebadores contienen uno o más nucleótidos selectivos en 45 el extremo 3.

7. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la endonucleasa de restricción es una endonucleasa de restricción de tipo II.

8. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la endonucleasa de restricción es una endonucleasa de restricción de tipo IIs.

9. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se usan dos o más endonucleasas de restricción.

10. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuenciación se realiza por medio de secuenciación de alto rendimiento.

11. Método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la secuenciación de alto rendimiento se realiza en un soporte sólido. 60

12. Método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la secuenciación de alto rendimiento se basa en Secuenciación por Síntesis.

13. Método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la secuenciación de alto rendimiento comprende las 65 etapas de:

- hibridar los amplicones o fragmentos de restricción ligados al adaptador con perlas, hibridándose cada perla con un solo fragmento de restricción ligado al adaptador o amplicón; -emulsionar las perlas en microrreactores de agua en aceite, comprendiendo cada microrreactor de agua en aceite una sola perla;

-realizar PCR por emulsión para amplificar el fragmento de restricción ligado al adaptador o amplicones; -opcionalmente, seleccionar / enriquecer las perlas que contienen amplicones amplificados; -cargar las perlas en pocillos, comprendiendo cada pocillo una sola perla; y -generar una señal de pirofosfato.

14. Método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la secuenciación de alto rendimiento comprende las etapas de:

- hibridar los fragmentos de restricción ligados al adaptador o amplicones con una superficie que contiene el primer y segundo cebadores o la primera y segunda secuencias de unión al cebador respectivamente.

15. realizar amplificación por puente para proporcionar fragmentos de restricción ligados al adaptador amplificados o amplicones amplificados, -determinar la secuencia de nucleótidos de los fragmentos de restricción ligados al adaptador amplificados o amplicones amplificados usando nucleótidos terminadores reversibles marcados.

15. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el identificador tiene de 4 a 16 pb, preferentemente de 4 a 10 pb, más preferentemente de 4 a 8 pb, lo más preferentemente de 4 a 6 pb.

16. Método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el identificador no contiene 2 o más bases consecutivas idénticas. 25

17. Método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que, para dos o más muestras, los identificadores correspondientes contienen al menos dos nucleótidos diferentes.

18. Uso del método como se define en las reivindicaciones 1-17 para la identificación de marcadores moleculares,

para genotipificación, análisis de segregación en masa, formación de mapas genéticos, retrocruzamiento asistido por marcador, formación de mapas de sitios de rasgos cuantitativos, formación de mapas de desequilibrio de unión.