Proteínas de fusión de RAGE y métodos de uso.

Proteína de fusión que comprende un polipéptido de RAGE unido directamente a un polipéptido distinto de RAGE,

en la que el polipéptido distinto de RAGE comprende (i) un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina que puede plegarse, y (ii) un dominio CH3 de una inmunoglobulina; en la que el polipéptido de RAGE comprende un sitio de unión a ligando de RAGE; en la que el polipéptido de RAGE comprende un ligador interdominio de RAGE unido a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de manera que el aminoácido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE está unido al aminoácido N-terminal del ligador interdominio de RAGE, y el aminoácido C-terminal del ligador interdominio de RAGE está unido directamente al aminoácido N-terminal del polipéptido distinto de RAGE; y en la que la proteína de fusión comprende un ligador interdominio derivado de RAGE en vez de un polipéptido 15 bisagra interdominio derivado de una inmunoglobulina.

Proteïnas de fusiïn de RAGE y mïtodos de uso

Campo de la invenciïn La presente invenciïn se refiere a la regulaciïn del receptor para productos finales de glicosilaciïn avanzada (Receptor for Advanced Glycated Endproducts) (RAGE) . Mïs particularmente, la presente invenciïn describe proteïnas de fusiïn que comprenden un polipïptido de RAGE, mïtodos de preparaciïn de tales proteïnas de fusiïn y el uso de tales proteïnas para el tratamiento de trastornos basados en RAGE.

Antecedentes La incubaciïn de proteïnas o lïpidos con azïcares aldosa da como resultado la oxidaciïn y glicosilaciïn no enzimïticas de grupos amino en proteïnas para formar aductos de Amadori. Con el tiempo, los aductos experimentan transposiciones, deshidrataciones y reticulaciones adicionales con otras proteïnas para formar complejos conocidos como productos finales de glicosilaciïn avanzada (AGE) . Los factores que promueven la formaciïn de AGE incluyen recambio de proteïnas retrasado (por ejemplo como en amiloidosis) , acumulaciïn de macromolïculas que tienen un alto contenido en lisina y altos niveles de glucosa en sangre (por ejemplo como en diabetes) (Hori et al., J. Biol. Chem. 270: 25752-761, (1995) ) . Se ha implicado a los AGE en una variedad de trastornos incluyendo complicaciones asociadas con diabetes y envejecimiento normal.

Los AGE presentan uniïn especïfica y saturable a receptores de superficie celular en monocitos, macrïfagos, cïlulas endoteliales de la microvasculatura, cïlulas de mïsculo liso, cïlulas mesangiales y neuronas. El receptor

para productos finales de glicosilaciïn avanzada (RAGE) es un miembro de la familia de molïculas de supergenes de inmunoglobulinas. El dominio extracelular (N-terminal) de RAGE incluye tres regiones de tipo inmunoglobulina: un dominio de tipo V (variable) seguido por dos dominios de tipo C (constante) (Neeper et al., J. Biol. Chem., 267:14998-15004 (1992) ; Schmidt et al., Circ. (supl.) 96#194 (1997) ) . Un ïnico dominio que se extiende a travïs de la membrana y una cola citosïlica corta, altamente cargada siguen al dominio extracelular. El dominio N-terminal, extracelular puede aislarse mediante proteïlisis de RAGE o mediante enfoques de biologïa molecular para generar RAGE soluble (RAGEs) compuesto por los dominios V y C.

RAGE se expresa en mïltiples tipos de cïlulas incluyendo leucocitos, neuronas, cïlulas de la microglïa y endotelio vascular (por ejemplo, Hori et al., J. Biol. Chem., 270:25752-761 (1995) ) . Tambiïn se encuentran niveles aumentados de RAGE en tejidos envejecidos (Schleicher et al., J. Clin. Invest., 99 (3) : 457-468 (1997) ) , y la retina, la vasculatura y el riïïn diabïticos (Schmidt et al., Nature Med., 1:1002-1004 (1995) ) . Tambiïn se encuentran niveles aumentados de RAGE en tejidos envejecidos (Schleicher et al., J. Clin. Invest., 99 (3) : 457-468 (1997) ) , y la retina, la vasculatura y el riïïn diabïticos (Schmidt et al., Nature Med., 1:1002-1004 (1995) ) .

Ademïs de AGE, otros compuestos pueden unirse a y modular RAGE. RAGE se une a mïltiples ligandos funcional y estructuralmente diversos incluyendo amiloide beta (Aβ) , amiloide A sïrico (SAA) , productos finales de glicosilaciïn avanzada (AGE) , S100 (un miembro proinflamatorio de la familia de calgranulina) , carboximetil-lisina (CML) , anfoterina y CD11b/CD18 (Bucciarelli et al., Cell Mol. Life Sci., 59:1117-128 (2002) ; Chavakis et al., Microbes Infect., 6:1219-1225 (2004) ; Kokkola et al., Scand. J. Immunol., 61:1-9 (2005) ; Schmidt et al., J. Clin. Invest., 108:949-955

(2001) ; Rocken et al., Am. J. Pathol., 162:1213-1220 (2003) ) .

Se ha mostrado que la uniïn de ligandos tales como AGE, S100/calgranulina, β-amiloide, CML (Nε-carboximetillisina) y anfoterina a RAGE modifica la expresiïn de una variedad de genes. Estas interacciones pueden iniciar entonces mecanismos de transducciïn de seïales incluyendo activaciïn de p38, fosforilaciïn de Erk1-2, MAP cinasas, p21ras y la activaciïn del mediador transcripcional de seïalizaciïn inflamatoria, NF-κB (Yeh et al., Diabetes, 50:1495-1504 (2001) ) . Por ejemplo, en muchos tipos de cïlulas, la interacciïn entre RAGE y sus ligandos puede generar estrïs oxidativo, que de ese modo da como resultado la activaciïn del factor de transcripciïn sensible a radicales libres NF-κB, y la activaciïn de genes regulados por NF-κB, tales como las citocinas IL-1β y TNF-α. Ademïs, la expresiïn de RAGE se regula por incremento por medio de NF-κB y muestra expresiïn 55 aumentada en sitios de inflamaciïn o estrïs oxidativo (Tanaka et al., J Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000) ) . Por tanto, puede alimentarse una espiral ascendente y a menudo perjudicial mediante un bucle de retroalimentaciïn positiva iniciado por la uniïn del ligando.

La activaciïn de RAGE en diferentes tejidos y ïrganos puede conducir a varias consecuencias fisiopatolïgicas. Se ha implicado a RAGE en una variedad de estados incluyendo: inflamaciïn aguda y crïnica (Hofmann et al., Cell 97: 889-901 (1999) ) , el desarrollo de complicaciones diabïticas tardïas tales como aumento de la permeabilidad vascular (Wautier et al., J. Clip. Invest., 97:238-243 (1995) ) , nefropatïa (Teillet et al., J. Am. Soc. Nephrol., 11:14881497 (2000) ) , arteriosclerosis (Vlassara et al., The Finnish Medical Society DUODECIM, Ann. Med., 28:419-426 (1996) ) y retinopatïa (Hammes et al., Diabetologia, 42:603-607 (1999) ) . Se ha implicado a RAGE tambiïn en 65 enfermedad de Alzheimer (Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996) ) y en invasiïn y metïstasis tumorales (Taguchi et

al., Nature, 405:354-357 (2000) ) .

A pesar de la amplia expresiïn de RAGE y su aparente papel pleiotrïpico en mïltiples modelos de enfermedad diversos, RAGE no parece ser esencial para el desarrollo normal. Por ejemplo, ratones deficientes en RAGE no tienen un fenotipo anïmalo manifiesto, lo que sugiere que aunque RAGE puede desempeïar un papel en la patologïa de la enfermedad cuando se estimula de manera crïnica, la inhibiciïn de RAGE no parece contribuir a ningïn fenotipo agudo no deseado (Liliensiek et al., J. Clin. Invest., 113:1641-50 (2004) ) .

La uniïn antagonizante de ligandos fisiolïgicos a RAGE puede regular por disminuciïn los cambios fisiopatolïgicos provocados por concentraciones excesivas de AGE y otros ligandos de RAGE. Reduciendo la uniïn de ligandos endïgenos a RAGE, pueden reducirse los sïntomas asociados con trastornos mediados por RAGE. RAGE soluble (RAGEs) puede antagonizar eficazmente la uniïn de ligandos de RAGE a RAGE. Sin embargo, RAGEs puede tener una semivida cuando se administra in vivo que puede ser demasiado corta como para ser terapïuticamente ïtil para uno o mïs trastornos. Por tanto, hay una necesidad de desarrollar compuestos que antagonicen la uniïn de AGE y

otros ligandos fisiolïgicos al receptor RAGE teniendo el compuesto un perfil farmacocinïtico deseable.

Sumario Las realizaciones de la presente invenciïn comprenden proteïnas de fusiïn de RAGE y usos de tales proteïnas tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones de la presente invenciïn comprenden una proteïna de fusiïn que comprende un polipïptido de RAGE unido a un segundo polipïptido distinto de RAGE. La proteïna de fusiïn comprende un sitio de uniïn a ligando de RAGE. La proteïna de fusiïn comprende ademïs un polipïptido de RAGE unido directamente a un polipïptido que comprende el dominio CH2 de una inmunoglobulina, o una porciïn del dominio CH2.

La presente invenciïn tambiïn comprende un mïtodo para preparar una proteïna de fusiïn de RAGE. El mïtodo comprende unir un polipïptido de RAGE a un segundo polipïptido distinto de RAGE. El polipïptido de RAGE comprende un sitio de uniïn a ligando de RAGE. El mïtodo puede comprender unir un polipïptido de RAGE directamente a un polipïptido que comprende el dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porciïn del dominio CH2.

Tambiïn se dan a conocer en el presente documento mïtodos y composiciones para tratar un trastorno mediado por RAGE en un sujeto. El mïtodo puede comprender administrar una proteïna de fusiïn de la presente invenciïn al sujeto. La composiciïn puede comprender una proteïna de fusiïn de RAGE de la presente invenciïn en un portador

farmacïuticamente aceptable.

Hay diversas ventajas que pueden estar asociadas con realizaciones particulares de la presente invenciïn. En una realizaciïn, las proteïnas de fusiïn de la presente invenciïn pueden ser estables metabïlicamente cuando se administran a un sujeto. Ademïs, las proteïnas de fusiïn de la presente invenciïn pueden presentar uniïn de alta afinidad para ligandos de RAGE. En determinadas... [Seguir leyendo]

1. Proteïna de fusiïn que comprende un polipïptido de RAGE unido directamente a un polipïptido distinto de RAGE,

en la que el polipïptido distinto de RAGE comprende (i) un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o una porciïn de un dominio CH2 de una inmunoglobulina que puede plegarse, y (ii) un dominio CH3 de una inmunoglobulina;

en la que el polipïptido de RAGE comprende un sitio de uniïn a ligando de RAGE;

en la que el polipïptido de RAGE comprende un ligador interdominio de RAGE unido a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de manera que el aminoïcido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE estï unido al aminoïcido N-terminal del ligador interdominio de RAGE, y el aminoïcido C-terminal del ligador interdominio de RAGE estï unido directamente al aminoïcido N-terminal del polipïptido distinto de RAGE; y

en la que la proteïna de fusiïn comprende un ligador interdominio derivado de RAGE en vez de un polipïptido bisagra interdominio derivado de una inmunoglobulina.

2. Proteïna de fusiïn segïn la reivindicaciïn 1, en la que la proteïna de fusiïn comprende (a) el ligador interdominio de RAGE que separa los dominios V y C1 de RAGE o (b) el ligador interdominio de RAGE que separa los dominios C1 y C2 de RAGE, en lugar de la regiïn bisagra de la cadena pesada de inmunoglobulina.

3. Proteïna de fusiïn segïn la reivindicaciïn 1 o la reivindicaciïn 2, en la que el polipïptido de RAGE comprende un fragmento de RAGEs humano, en la que la secuencia de RAGEs humano se expone en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.

4. Proteïna de fusiïn segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proteïna de fusiïn comprende un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer ligador interdominio de RAGE unido a un segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y un segundo ligador interdominio de RAGE, de manera que el aminoïcido Nterminal del primer ligador interdominio de RAGE estï unido al aminoïcido C-terminal del primer dominio de inmunoglobulina de RAGE, el aminoïcido N-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE estï unido al aminoïcido C-terminal del primer ligador interdominio de RAGE, el aminoïcido N-terminal del segundo ligador interdominio de RAGE estï unido al aminoïcido C-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y el aminoïcido C-terminal del segundo ligador interdominio de RAGE estï unido directamente al aminoïcido N-terminal del dominio CH2 de la inmunoglobulina o la porciïn del dominio CH2 de la inmunoglobulina del polipïptido distinto de RAGE.

5. Proteïna de fusiïn segïn la reivindicaciïn 4, en la que el segundo ligador interdominio de RAGE comprende la secuencia de aminoïcidos expuesta en SEQ ID NO: 22 o una secuencia idïntica al menos en un 90% a la misma, o la secuencia de aminoïcidos expuesta en SEQ ID NO: 24 o una secuencia idïntica al menos en un 90% a la misma.

6. Proteïna de fusiïn segïn la reivindicaciïn 1, en la que el polipïptido de RAGE es un ïnico dominio de inmunoglobulina de RAGE unido por medio de un ligador interdominio de RAGE al aminoïcido N-terminal del polipïptido distinto de RAGE.

7. Proteïna de fusiïn segïn la reivindicaciïn 6, en la que el ligador interdominio de RAGE comprende la secuencia de aminoïcidos expuesta en SEQ ID NO: 21 o una secuencia idïntica al menos en un 90% a la misma, o la secuencia de aminoïcidos expuesta en SEQ ID NO: 23 o una secuencia idïntica al menos en un 90% a la misma.

8. Proteïna de fusiïn segïn una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el sitio de uniïn a ligando de RAGE comprende SEQ ID NO: 9 o una secuencia idïntica al menos en un 90% a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia idïntica al menos en un 90% a la misma.

9. Proteïna de fusiïn segïn la reivindicaciïn 1, en la que el polipïptido de RAGE comprende la secuencia de aminoïcidos expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20 o una secuencia idïntica al menos en un 90% a las mismas.

10. Proteïna de fusiïn segïn la reivindicaciïn 1, en la que la secuencia de aminoïcidos del polipïptido de RAGE se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20.

11. Proteïna de fusiïn segïn la reivindicaciïn 1, en la que la secuencia de aminoïcidos del polipïptido distinto de RAGE es o comprende la secuencia de aminoïcidos expuesta en SEQ ID NO: 38.

12. Proteïna de fusiïn segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana seleccionada del grupo que consiste en: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.

13. Proteïna de fusiïn segïn la reivindicaciïn 12, en la que la inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

14. Proteïna de fusiïn segïn la reivindicaciïn 13, en la que la inmunoglobulina es IgG1.

15. Proteïna de fusiïn segïn la reivindicaciïn 1, que comprende la secuencia de aminoïcidos expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37.

16. Proteïna de fusiïn segïn la reivindicaciïn 1, que tiene la secuencia de aminoïcidos expuesta en SEQ ID NO: 37.

17. Proteïna de fusiïn segïn la reivindicaciïn 1, que tiene la secuencia de aminoïcidos expuesta en SEQ ID NO: 34.

18. Proteïna de fusiïn segïn la reivindicaciïn 1, que puede codificarse por la secuencia de ïcido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 30.

19. Proteïna de fusiïn segïn la reivindicaciïn 1, que puede codificarse por la secuencia de ïcido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 31.

20. ïcido nucleico que codifica para una proteïna de fusiïn segïn cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

21. ïcido nucleico segïn la reivindicaciïn 20, en el que la secuencia de ïcido nucleico que codifica para el polipïptido de RAGE es o comprende la secuencia de ïcido nucleico expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29.

22. ïcido nucleico segïn la reivindicaciïn 20, que comprende la secuencia de ïcido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31.

23. Vector de expresiïn que codifica para una proteïna de fusiïn segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y/o que comprende un ïcido nucleico segïn una cualquiera de las reivindicacione.

2. 22.

24. Composiciïn farmacïutica que comprende una cantidad terapïuticamente eficaz de una proteïna de fusiïn segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 en un portador farmacïutico.

25. Composiciïn farmacïutica segïn la reivindicaciïn 24, formulada como o bien una disoluciïn inyectable o bien un polvo liofilizado estïril.

26. Mïtodo in vitro de preparaciïn de una proteïna de fusiïn segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 que comprende la etapa de unir covalentemente el polipïptido de RAGE al polipïptido distinto de RAGE.

27. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 26, en el que la proteïna de fusiïn puede obtenerse eliminando la regiïn bisagra FC de la inmunoglobulina y reemplazïndola por el polipïptido de RAGE.

28. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 26, en el que la proteïna de fusiïn estï codificada por un constructo de ADN recombinante.

29. Mïtodo segïn una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, que comprende ademïs la etapa de incorporar el constructo de ADN en un vector de expresiïn.

30. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 29, que comprende ademïs transfectar el vector de expresiïn en una cïlula huïsped.

31. Uso de una proteïna de fusiïn segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la preparaciïn de un medicamento para el tratamiento de un trastorno mediado por RAGE en un sujeto.

32. Uso segïn la reivindicaciïn 31, en el que el medicamento estï destinado para administraciïn intravenosa, intraperitoneal o subcutïnea de la proteïna de fusiïn de RAGE al sujeto.

33. Uso segïn la reivindicaciïn 31 o 32, en el que el medicamento estï destinado a tratar un sïntoma de diabetes o un sïntoma de complicaciones diabïticas tardïas.

34. Uso segïn la reivindicaciïn 33, en el que el sïntoma de diabetes o complicaciones diabïticas tardïas comprende nefropatïa diabïtica, retinopatïa diabïtica, una ïlcera de pie diabïtico, una complicaciïn cardiovascular o neuropatïa diabïtica.

35. Uso segïn la reivindicaciïn 31 ï 32, en el que el medicamento estï destinado a tratar amiloidosis; enfermedad de Alzheimer; cïncer; insuficiencia renal; o inflamaciïn asociada con cualquiera de autoinmunidad, enfermedad

inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis mïltiple, hipoxia, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, choque hemorrïgico, septicemia, trasplante de ïrgano o cicatrizaciïn de heridas alterada.

36. Cïlula huïsped aislada que comprende un vector de expresiïn segïn la reivindicaciïn 23.

37. Cïlula huïsped segïn la reivindicaciïn 36, en la que la cïlula huïsped es una cïlula de ovario de hïmster chino.

38. Mïtodo de producciïn de una proteïna de fusiïn que comprende cultivar una cïlula huïsped segïn la reivindicaciïn 36 ï 37.