ENSAYO POR POLARIZACION DE FLUORESCENCIA.

Un procedimiento para detectar moduladores del RAGE (receptor de productos finales avanzados de la glicosilación) que comprende:



(a) proporcionar (i) un polipéptido RAGE que comprende un dominio de unión al ligando del RAGE, (ii) un ligando fluorescente del RAGE, en el que el ligando fluorescente del RAGE comprende un polipéptido beta-amiloide; y (iii) un compuesto de interés;

(b) añadir el compuesto de interés y el ligando fluorescente del RAGE al polipéptido RAGE; y

(c) medir la polarización del ligando fluorescente del RAGE; y

(d) correlacionar el nivel de polarización con la cantidad de ligando fluorescente del RAGE que está unido al polipéptido RAGE

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2005/009005.

Solicitante: TRANSTECH PHARMA INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: SUITE 110, 4170 MENDENHALL OAKS PARKWAY,HIGH POINT, NC 27265.

Inventor/es: MJALLI,ADNAN,M.,M, WEBSTER,JEFFREY,C.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 6 de Enero de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • G01N33/542 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › con inhibición estérica o modificación de la señal, p. ej. extinción de fluorescencia.
  • G01N33/58D
  • G01N33/68A8

Clasificación PCT:

  • G01N33/53 G01N 33/00 […] › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
  • G01N33/542 G01N 33/00 […] › con inhibición estérica o modificación de la señal, p. ej. extinción de fluorescencia.
  • G01N33/566 G01N 33/00 […] › utilizando un soporte específico o proteínas receptoras como reactivos para la formación de uniones por ligando.
  • G01N33/58 G01N 33/00 […] › en los que intervienen sustancias marcadas (G01N 33/53 tiene prioridad).

Clasificación antigua:

  • G01N33/53 G01N 33/00 […] › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
  • G01N33/566 G01N 33/00 […] › utilizando un soporte específico o proteínas receptoras como reactivos para la formación de uniones por ligando.

Fragmento de la descripción:

Ensayo por polarización de fluorescencia.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de procedimientos y sistemas que usan la polarización de la fluorescencia para identificar compuestos que tienen la capacidad de modular al receptor de productos finales avanzados de la glicosilación (RAGE).

Antecedentes

La incubación de proteínas o lípidos con azúcares aldosas da como resultado la glicosilación y la oxidación no enzimáticas de los grupos amino de las proteínas para formar aductos de Amadori. Con el tiempo, los aductos sufren otras reorganizaciones, deshidrataciones y el entrecruzamiento con otras proteínas para formar complejos conocidos como productos finales avanzados de la glicosilación (AGE). Los factores que promueven la formación de los AGE incluyen la renovación retardada de proteínas (p. ej., como en las amiloidasas), la acumulación de macromoléculas que tienen un alto contenido de lisina y los niveles elevados de glucosa en sangre (p. ej., como en la diabetes) (Hori et al., J. Biol. Chem. 270: 25752-761, (1995)). Los AGE han estado implicados en una variedad de trastornos incluyendo las complicaciones asociadas con la diabetes y el envejecimiento normal.

Los AGE presentan una unión específica y saturable con los receptores de la superficie celular en monocitos, macrófagos, células endoteliales de la microvasculatura, células del músculo liso, células mesengiales y neuronas. El receptor de los productos finales avanzados de la glicosilación (RAGE) forma parte de la super-familia de moléculas de la superficie celular que son las inmunoglobulinas. El dominio extracelular (N-terminal) del RAGE incluye tres regiones de tipo inmunoglobulina: un dominio de tipo V (variable) seguido por dos dominios de tipo C (constantes) (Neeper et al., J. Biol. Chem., 267:14998-15004 (1992); Schmidt et al., Circ. (Supl.) 96#194 (1997)). Un solo dominio que abarca la transmembrana y una cola citosólica corta muy cargada siguen al dominio extracelular. El dominio extracelular N-terminal puede ser aislado mediante la proteolisis del RAGE o mediante enfoques de Biología Molecular para generar el RAGE soluble (RAGEs) compuesto de los dominios V y C.

El RAGE se expresa en la mayoría de los tejidos y, en particular, se encuentra en las neuronas corticales durante la embriogénesis (Hori et al., J. Biol. Chem., 270:25752-761 (1995)). También se encuentran mayores niveles de RAGE en los tejidos en envejecimiento (Schleicher et al., J. Clin. Invest, 99 (3): 457-468 (1997)) y en la retina, la vasculatura y el riñón de los diabéticos (Schmidt et al., Nature Med., 1:1002-1004 (1995)). La activación del RAGE en diferentes tejidos y órganos conduce a un número de consecuencias patofisiológicas. El RAGE ha estado implicado en una variedad de afecciones que incluyen: la inflamación aguda y crónica (Hofmann et al., Cell 97:889-901 (1999)), el desarrollo de complicaciones diabéticas tardías tales como el aumento de la permeabilidad vascular (Wautier et al., J. Clin. Invest, 97:238-243 (1995)), la nefropatía (Teillet et al., J. Am. Soc. Nephrol, 11:1488-1497 (2000)), la aterosclerosis (Vlassara et. al., The Finnish Medical Society DUODECIM, Ann. Med, 28:419-426 (1996)) y la retinopatía (Hammes et al, Diabetologia, 42:603-607 (1999)). El RAGE también ha estado implicado en la enfermedad de Alzheimer (Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996)), la disfunción eréctil, y la invasión y la metástasis tumoral (Taguchi et al., Nature, 405:354-357 (2000)).

Además de los AGE, hay otros compuestos que se pueden unir y modular a los RAGE. En el desarrollo normal, el RAGE interactúa con la anfoterina, un polipéptido que media el brote neurítico en neuronas embrionarias cultivadas (Hori et al., 1995). También se ha observado que el RAGE interactúa con la carboximetil-lisina (CML), con los ligandos de tipo calgranulina y con el ß-amiloide (Yan et al, Nature, 389:589-595, (1997); Yan et al, Nature, 382:685-691 (1996); Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 94:5296-5301 (1997)).

Se ha observado que la unión de ligandos tales como los AGE, S100/calgranulina, ß-amiloide, CML (Nvarepsilon-carboximetil-lisina) y anfoterina con el RAGE modifica la expresión de una variedad de genes. Por ejemplo, en muchos tipos de células, la interacción entre el RAGE y sus ligandos genera un estrés oxidativo que, de ese modo, da como resultado la activación del factor de transcripción sensible a radicales libres NF-?B, y la activación de genes regulados por el NF-?B, tales como las citocinas IL-1ß, TNF-a y similares. Además, se ha observado que otras diversas rutas reguladoras, tales como aquéllas que implican a p21ras, MAP quinasas, ERK1 y ERK2, son activadas mediante la unión de los AGE y de otros ligandos con el RAGE. De hecho, la transcripción del propio RAGE está regulada, al menos en parte, por el NF-Kb. De este modo, una creciente y, a menudo, perjudicial espiral se ve alimentada por un bucle de retroalimentación positiva iniciado por la unión de los ligandos.

El antagonismo de la unión de ligandos fisiológicos con el RAGE puede ser una diana lógica para la infra-regulación de los cambios patofisiológicos provocados por las concentraciones excesivas de los AGE y de otros ligandos del RAGE. Mediante la reducción de la unión de los ligandos endógenos con el RAGE, se pueden reducir los síntomas asociados con los trastornos mediados por el RAGE.

La solicitud de patente internacional W001/92892 revela procedimientos para detectar moduladores del RAGE y de ligandos, pero los procedimientos no están basados en ensayos de polarización fluorescente.

La publicación titulada "Fluorescence Polarisation and Anisotropy in High Throughput Screening: Perspectives and Primer", Owicki, J.C., Journal of Biomolecular Screening, Vol. 5, N.º 5, 2000) revela una variedad de pares de receptor-ligando que se pueden usar en análisis de rastreo. Sin embargo, el RAGE y el ß-amiloide no se encuentran entre los pares revelados.

Resumen

La invención se define en su forma más general en las reivindicaciones independientes 1 y 23:

Reivindicación 1:

Un procedimiento para detectar moduladores del RAGE que comprende:

(a) proporcionar (i) un polipéptido RAGE que comprende un dominio de unión al ligando del RAGE, (ii) un ligando fluorescente del RAGE, en el que el ligando fluorescente del RAGE comprende un polipéptido beta-amiloide y (iii) un compuesto de interés; (b) añadir el compuesto de interés y el ligando fluorescente del RAGE al polipéptido RAGE; y (c) medir la polarización del ligando fluorescente del RAGE; y (d) correlacionar el nivel de polarización con la cantidad del ligando fluorescente del RAGE que está unido al polipéptido RAGE.

Reivindicación 23:

quadUn sistema para la detección de compuestos que modulan la unión de un ligando con el RAGE usando los procedimientos de las reivindicaciones 1-22, que comprende recipientes envasados individualmente de: (a) un ligando fluorescente del RAGE, en el que el ligando fluorescente comprende un polipéptido beta-amiloide; (b) un polipéptido RAGE que comprende un dominio de unión al ligando del RAGE; y (c) al menos un reactivo de análisis para la dilución de (a) y (b) en presencia de un compuesto de interés, tal que se pueda cuantificar la unión del ligando fluorescente del RAGE con el polipéptido que comprende el dominio de unión al ligando del RAGE.

La presente memoria revela además procedimientos y sistemas que usan la polarización de la fluorescencia para identificar compuestos que tienen la capacidad de modular el receptor de productos finales avanzados de la glicosilación (RAGE). La presente memoria puede comprender procedimientos y/o sistemas de ensayo para descubrir los compuestos que pueden modular la unión de ligandos fisiológicos con el RAGE.

En una realización, la presente memoria comprende un procedimiento para la detección de moduladores del RAGE que comprende proporcionar (i) un polipéptido RAGE que comprende un dominio de unión al ligando del RAGE, (ii) un ligando fluorescente del RAGE e (iii) un compuesto de interés. El procedimiento puede comprender además la adición del compuesto de interés y del ligando fluorescente del RAGE al polipéptido RAGE, y la medición de la polarización del ligando fluorescente del RAGE.

En otra realización más, la memoria comprende un sistema para la detección de...

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para detectar moduladores del RAGE (receptor de productos finales avanzados de la glicosilación) que comprende:

(a) proporcionar (i) un polipéptido RAGE que comprende un dominio de unión al ligando del RAGE, (ii) un ligando fluorescente del RAGE, en el que el ligando fluorescente del RAGE comprende un polipéptido beta-amiloide; y (iii) un compuesto de interés;
(b) añadir el compuesto de interés y el ligando fluorescente del RAGE al polipéptido RAGE; y
(c) medir la polarización del ligando fluorescente del RAGE; y
(d) correlacionar el nivel de polarización con la cantidad de ligando fluorescente del RAGE que está unido al polipéptido RAGE.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además medir la cantidad de ligando fluorescente del RAGE unido al polipéptido RAGE en presencia de cantidades variables del compuesto de interés.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, que comprende además determinar la afinidad del compuesto de interés por el dominio de unión al ligando del RAGE en base a la cantidad del compuesto de interés necesaria para reducir la unión del ligando fluorescente del RAGE con el polipéptido RAGE en una cantidad predeterminada.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que se compara la capacidad del compuesto de interés para reducir la unión del ligando fluorescente del RAGE con los polipéptidos RAGE con la capacidad de un segundo compuesto para reducir la unión del ligando fluorescente del RAGE con el polipéptido RAGE.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el segundo compuesto no se une sustancialmente con el dominio de unión al ligando del RAGE, tal que el segundo compuesto funciona como un control negativo para la medición de la unión con el dominio de unión al ligando del RAGE.

6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el segundo compuesto comprende una afinidad de unión sustancial por el dominio de unión al ligando del RAGE, tal que el segundo compuesto funciona como un control positivo para la medición de la unión con el dominio de unión al ligando del RAGE.

7. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el segundo compuesto comprende al menos una variante estructural o una variante química del compuesto de interés.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que se preincuba el ligando fluorescente del RAGE para promover la auto-agregación del polipéptido beta-amiloide en una forma laminar plisada.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el péptido beta-amiloide comprende el beta-amiloide (1-40) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID N.º 5, o el beta-amiloide (1-42) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID N.º 6.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el resto de fluoresceína se une al terminal amino del polipéptido beta-amiloide.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polipéptido que comprende un dominio de unión al ligando del RAGE comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N.º 4, SEC ID N.º 3 o SEC ID N.º 7, o una secuencia que es al menos un 90% idéntica a la misma.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polipéptido que comprende un dominio de unión al ligando del RAGE está unido covalentemente, o se le permite formar un complejo, con un segundo polipéptido.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que al polipéptido que comprende un dominio de unión al ligando del RAGE se le permite formar un complejo con un anticuerpo que reconoce al RAGE o a un fragmento del mismo.

14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el compuesto de interés comprende al menos uno entre una molécula orgánica, un péptido, un peptidomimético, un compuesto inorgánico, un lípido, un carbohidrato o un ácido nucleico.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la molécula orgánica pequeña tiene un peso molecular de menos del 1.000 daltons.

16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el compuesto de interés es un antagonista del RAGE.

17. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el compuesto de interés es un agonista del RAGE.

18. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el compuesto de interés se une al dominio de unión al ligando del polipéptido RAGE.

19. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la concentración del ligando fluorescente en el ensayo varía de 1 pM a 50 µM o de 0,005 nM a 5 µM o de 0,05 nM a 500 nM o de 0,5 nM a 50 nM.

20. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la concentración del polipéptido que comprende un sitio de unión al ligando del RAGE en el ensayo varía de 0,001 nM a 50 µM o de 0,01 nM a 5 µM o de 0,1 nM a 500 nM o de 1 nM a 100 nM.

21. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el control negativo presenta una constante de disociación (Kd) para la unión con el dominio de unión al ligando del RAGE de más de 5 µM o de más de 10 µM o de más de 50 µM o de más de 100 µM o de más de 1 mM.

22. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el control positivo presenta una constante de disociación (Kd) para la unión con el dominio de unión al ligando del RAGE de menos de 1 µM o de menos de 200 nM o de menos de 50 nM o de menos de 10 nM.

23. Un sistema para la detección de compuestos que modulan la unión de un ligando con el RAGE usando los procedimientos de las reivindicaciones 1-22, que comprende recipientes envasados individualmente de:

(a) un ligando fluorescente del RAGE, en el que el ligando fluorescente comprende un polipéptido beta-amiloide;
(b) un polipéptido RAGE que comprende un dominio de unión al ligando del RAGE; y (c) al menos un reactivo de análisis para la dilución de (a) y (b) en presencia de un compuesto de interés, tal que se pueda cuantificar la unión del ligando fluorescente del RAGE con el polipéptido que comprende el dominio de unión al ligando del RAGE.

24. El sistema de la reivindicación 23, que comprende además un dispositivo para medir la polarización del ligando fluorescente.

25. El sistema de la reivindicación 23, que comprende además un compuesto que comprende una afinidad de unión predeterminada por el dominio de unión al ligando del RAGE.

26. El sistema de la reivindicación 25, en el que el compuesto que comprende una afinidad de unión predeterminada por el dominio de unión al ligando del RAGE no se une sustancialmente con el dominio de unión del RAGE, tal que el segundo compuesto funciona como un control negativo para la medición de la unión con el dominio de unión al ligando del RAGE.

27. El sistema de la reivindicación 25, en el que el segundo compuesto comprende una afinidad de unión sustancial por el dominio de unión del RAGE, tal que el segundo compuesto funciona como un control positivo para la medición de la unión con el dominio de unión al ligando del RAGE.

28. El sistema de la reivindicación 23, que comprende además un segundo polipéptido que está ligado a o que puede formar un complejo con el polipéptido RAGE.

29. El sistema de la reivindicación 28, en el que el segundo polipéptido comprende un anticuerpo que reconoce al RAGE o a un fragmento del RAGE.


 

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