Procedimientos de producción de células silenciadas u organismos silenciados por medio de mediadores específicos de secuencia de ARN de interferencia de ARN y usos de los mismos.

Un procedimiento de producción de una célula silenciada, que comprende introducir en una célula en la que se va a silenciar un gen ARN de doble hebra de 21 a 23 nt que tiene como objetivo el ARNm correspondiente al gen;

y mantener la célula resultante en condiciones en las que se produce la iARN, dando como resultado la degradación del ARNm del gen, produciendo de este modo la célula silenciada;

siempre que el procedimiento no sea un un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal por ciruría o terapia, o un procedimiento diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal.

Procedimientos de producción de células silenciadas u organismos silenciados por medio de mediadores específicos de secuencia de ARN de interferencia de ARN y usos de los mismos

Antecedentes de la invención La interferencia por ARN o “iARN” es un término inicialmente acuñado por Fire y colaboradores para describir la observación de que el ARN bicatenario (ARNbc) puede bloquear la expresión génica cuando se introduce en gusanos (Fire et al. (1998) Nature 391, 806-811) . El ARNbc dirige el silenciamiento postranscripcional, específico de genes en muchos organismos, incluyendo vertebrados y ha proporcionado una nueva herramienta para el estudio de la función génica. La iARN implica la degradación del ARNm, pero se desconocen muchos de los mecanismos bioquímicos subyacentes a esta interferencia. Se necesita la recapitulación de las características principales de la iARN in vitro para el análisis bioquímico del fenómeno.

Sumario de la invención La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Se describe en el presente documento interferencia mediada por ARNbc, específica de genes en un sistema libre de células derivado de embriones de Drosophila blastodérmicos sincitiales. El sistema in vitro complementa enfoques genéticos para analizar minuciosamente la base molecular de la iARN. Como se describe en el presente documento, se examinaron los mecanismos moleculares subyacentes a la iARN usando el sistema in vitro de Drosophila. Los resultados mostraron que la iARN es dependiente de ATP aunque se desacople de la traducción del ARNm. Es decir, no se requiere la síntesis de proteínas para la iARN in vitro. En la reacción de iARN, ambas cadenas (sentido y antisentido) del ARNbc se procesan dando lugar a fragmentos o segmentos pequeños de ARN desde aproximadamente 21 hasta aproximadamente 23 nucleótidos (nt) de longitud (los ARN con movilidad en geles de secuenciación que corresponden a marcadores que son de 21-23 nt de longitud, denominados opcionalmente en lo sucesivo ARN de 21-23 nt) . El procesamiento del ARNbc en fragmentos pequeños de ARN no requiere el ARNm seleccionado como diana, lo que demuestra que las especies pequeñas de ARN se generan mediante el procesamiento del ARNbc y no como un producto de degradación de ARNm dirigido por ARNbc. El ARN solo se escinde dentro de la región de identidad con el ARNbc. La escisión se produce en sitios separados en 21-23 nucleótidos, el mismo intervalo observado para el propio ARNbc, lo que sugiere que los fragmentos de 21-23 nucleótidos del ARNbc guían la escisión del ARNm. Esos ARN purificados de 21-23 nt que median en la iARN confirman que estos fragmentos están guiando la escisión del ARNm.

Por consiguiente, se describen en el presente documento moléculas de ARN aisladas (bc) desde aproximadamente 21 hasta aproximadamente 23 nucleótidos que median en la iARN. Es decir, los ARN aislados median la degradación de ARNm de un gen al que corresponde el ARN (median en la degradación del ARNm que es el producto transcripcional del gen, que también se denomina en lo sucesivo gen diana) . Por conveniencia, tal ARNm también se denomina en lo sucesivo en el presente documento ARNm que va a degradarse. Como se usa en el presente documento, los términos ARN, molécula (s) de ARN, segmento (s) de ARN y fragmento (s) de ARN se usan indistintamente para referirse al ARN que media en la interferencia por ARN. El ARN bicatenario puede ser ARN aislado (ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido de manera recombinante) así como ARN alterado que difiere del ARN que se produce de manera natural mediante la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Tales alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como al/a los extremo (s) del ARN de 21-23 nt o internamente (a uno o más nucleótidos del ARN) . Los nucleótidos en las moléculas de ARN de la presente invención pueden comprender también nucleótidos no convencionales, incluyendo nucleótidos que no se producen de manera natural o desoxirribonucleótidos. Colectivamente, todos los ARN alterados se denominan en lo sucesivo análogos o análogos de ARN que se producen de manera natural. El ARNbc de 21-23 nucleótidos de la presente invención solo necesita ser suficientemente similar al ARN natural que tiene la capacidad para mediar (media) en la iARN. Tal como se usa en el

presente documento, la expresión “media en la iARN” se refiere a (indica) la capacidad para distinguir que ARN van a degradarse mediante la maquinaria o el procedimiento de la iARN. El ARN que media en la iARN interactúa con la maquinaria de la iARN de tal manera que dirige la maquinaria para degradar ARNm particulares. En una realización, la presente divulgación se refiere a las moléculas de ARNbc de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos que dirigen la escisión del ARNm específico al que corresponde su secuencia. No es necesario que la correspondencia de las secuencias sea perfecta, sino que la correspondencia debe ser suficiente para permitir que el ARN dirija la escisión por iARN del ARNm diana. En una realización particular, las moléculas de ARN de 21-23 nt de la presente invención comprenden un grupo hidroxilo en 3’.

La presente divulgación también se refiere a procedimientos para producir moléculas de ARN de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos con capacidad para mediar la escisión por iARN. En una realización, se usa el sistema in vitro de Drosophila. En esta realización, se combina el ARNbc con un extracto soluble derivado de embrión de Drosophila, produciendo de este modo una combinación. La combinación se mantiene en condiciones en las que el ARNbc se procesa para dar moléculas de ARN de 21 a 23 nucleótidos de longitud. En otra realización, se usa el sistema in vitro de Drosophila para obtener secuencias de ARN de 21-23 nucleótidos que median en la interferencia por ARN del ARNm de un gen particular (por ejemplo, oncogén, gen viral) . En esta realización, el ARN bicatenario que corresponde a una secuencia del gen que va seleccionarse como diana se combina con un extracto soluble derivado del embrión de Drosophila, produciendo de este modo una combinación. La combinación se mantiene en condiciones en las que el ARN bicatenario se procesa para dar lugar a ARN de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos de longitud. Como se muestra en el presente documento, el ARN de 21-23 nt media en la iARN del ARNm del gen seleccionado como diana (el gen cuyo ARNm va a degradarse) . El procedimiento para obtener los ARN de 21-23 nt utilizando el sistema in vitro de Drosophila además puede comprender aislar la secuencia de ARN de la combinación.

La presente divulgación también se refiere a ARNbc de 21-23 nt producido mediante los procedimientos divulgados en la presente invención, así como a los ARN de 21-23 nt, producidos mediante otros procedimientos, tales como síntesis química o técnicas de ADN recombinante, que tienen las mismas o substancialmente las mismas secuencias que los ARN producidos de manera natural que median en la iARN, tales como los producidos mediante los procedimientos de la presente divulgación. Todos estos se denominan en lo sucesivo ARNbc de 21-23 nt que median en la interferencia por ARN. Como se usa en el presente documento, el término ARN aislado incluye el ARN obtenido mediante cualquier medio, incluyendo el procesamiento o escisión del ARNbc tal como se describe en el presente documento; la producción mediante procedimientos de síntesis química; y la producción mediante técnicas de ADN recombinante. La divulgación también se refiere a los usos de los ARN de 21-23 nt, tales como para el tratamiento terapéutico o profiláctico y para las composiciones que comprenden los ARN de 21-23 nt que median la iARN, tales como las composiciones farmacéuticas que comprenden los ARN de 21-23 nt y un vehiculo apropiado (por ejemplo, un tampón o agua) .

La presente divulgación también se refiere a un procedimiento para mediar en la interferencia por ARN del ARNm de un gen en una célula u organismo (por ejemplo, un mamífero tal como un ratón o un ser humano) . En una realización, se introduce el ARNbc de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nt que se dirige al ARNm que va a degradarse en la célula o el organismo. La célula o el organismo se mantienen en las condiciones en que se produce la degradación del ARNm, mediando de este modo la interferencia por ARN del ARNm del gen en la célula o el organismo. La célula o el organismo puede ser uno en que se produce la iARN según se obtiene la célula o el organismo o una célula o un organismo puede ser uno que se ha modificado de modo que se produzca la iARN (por ejemplo, mediante... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de producción de una célula silenciada, que comprende introducir en una célula en la que se va a silenciar un gen ARN de doble hebra de 21 a 23 nt que tiene como objetivo el ARNm correspondiente al gen; y mantener la célula resultante en condiciones en las que se produce la iARN, dando como resultado la degradación del ARNm del gen, produciendo de este modo la célula silenciada;

siempre que el procedimiento no sea un un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal por ciruría o terapia, o un procedimiento diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el ARN de 21 a 23 nucleótidos es ARN sintético o comprende nucleótidos que no se producen de manera natural.

3. Un procedimiento de examinar la función de un gen, comprendiendo el procedimiento llevar a cabo el procedimiento de la reivindicación 1 o 2 y observar el fenotipo de la célula silenciada y compararlo con el de una célula control apropiada.

4. Un procedimiento de evaluar si un agente actúa sobre un gen, comprendiendo el procedimiento llevar a cabo el procedimiento de la reivindicación 1 o 2, introducir el agente en la célula y determinar si el agente tiene un 15 efecto en la célula.

5. Un procedimiento de validación de una diana para el descubrimiento de fármacos, comprendiendo el procedimiento llevar a cabo el procedimiento de la reivindicación 1 o 2 y determinar si la expresión disminuida del gen tiene un efecto en la célula.

Fig. 1

Fig. 2A Fig. 2B Fig. 3A

Fig. 3B Fig. 3C

Fig. 4

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