Preparación y uso de ciclodepsipéptidos antitumorales, antibióticos e insecticidas.

Compuesto de estructura general **Fórmula**

en la que R es un átomo de hidrógeno (H) y/o un alquilo C1-C20 no sustituido,

monosustituido o polisustituido, donde el alquilo está ramificado, es cíclico y/o parcialmente insaturado, o es un resto fenilo no sustituido, monosustituido o sustituido varias veces.

Preparación y uso de ciclodepsipéptidos antitumorales, antibióticos e insecticidas La presente invención se refiere a péptidos cíclicos, las Xenobovidas, que se son adecuadas para la preparación de medicamentos para el tratamiento de enfermedades infecciosas, tumorales, neurológicas y de base inflamatoria así como de diabetes. Otro ámbito de uso adicional de la invención es la preparación de insecticidas y agentes fitosanitarios. La invención se refiere además a un procedimiento para la producción de estos compuestos, mediante fermentación de una bacteria y purificación cromatográfica del extracto de bacterias, así como su uso como medicamento, insecticida y agente fitosanitario.

Determinados géneros de nematodos contienen simbiontes bacterianos que matan insectos. Los nematodos que viven en el cuerpo detectan insectos en la naturaleza y atraviesan la superficie del insecto, de modo que se inyectan bacterias patógenas en el hemocele del insecto. Estas bacterias producen antibióticos, enzimas y toxinas que matan el insecto. Los nematodos que se encuentran en el insecto se multiplican, generan varias bacterias y se liberan del cadáver en descomposición para buscar nuevos insectos.

Las bacterias del género Xenorhabdus, asociadas simbióticamente con nematodos Steinernema, son conocidas como fuente de un gran número de sustancias biológicamente activas. De estas bacterias entomopatógenas se aislaron distintas proteínas que son tóxicas para insectos. Esto es, por ejemplo, el caso de proteínas TC (“proteínas del complejo de toxina”) como se describen en el documento US 7285632 B2 o en el documento US 2008/0104731 A1, de proteínas “tipo TC” (documentos EP 1130970 B1, EP 1143800 B1) , o de una serie de otras proteínas de toxinas (documentos US 6048838, US 6174860 B1, US 6277823 B1, US 7214525 B1, US 6841165 B1) . Se conocen igualmente varias sustancias de efecto antibacteriano aisladas de estas bacterias: pseudopéptidos (documento EP 1351977 B1) , el péptido Xenorhabdicina (Thaler y col. 1995, Purification and characterization of xenorhabdicin, a phage tail-like bacteriocin, from the lysogenic strain Fl of Xenorhabdus nematophilus. Appl. Environ. Microbiol.

61:2049-2052) , la Xenorhabdina (documento EP 0192713 B1) , la Xenocoumacina (documento EP 0192713 B1) , la Nematofina (documento US 5569668) , la Xenomina (documento US 5827872) , o la Xenorxida (documento US 6316476 B1) . La Xenomina y Xenorxida presentan además actividad antineoplástica (documento US 6583171 B1) .

Los documentos DE 10252284 A1 y WO 2005/034982 A1 dan a conocer ciclopéptidos con propiedades farmacológicas, herbicidas y/o insecticidas.

En todo el mundo persiste una necesidad creciente de nuevos principios activos para el tratamiento de enfermedades infecciosas, cancerígenas e inflamatorias así como de diabetes y enfermedades neurológicas. Además hay una necesidad de nuevas sustancias que se puedan usar como insecticidas o agentes fitosanitarios.

Por tanto la presente invención se basa en el objetivo de proporcionar otros péptidos que sean de efecto antibiótico, antitumoral, antiinflamatorio, que reduzcan el nivel de azúcar en sangre, aumenten el nivel de acetilcolina o sean de efecto insecticida o inhiban la actividad de acetilcolinesterasa, fosfodiesterasa, proteína tirosina fosfatasa o la glicógeno-sintasa-quinasa, o sean efectivas contra agentes patógenos de enfermedades de las plantas, así como demostrar un modo para su producción.

De acuerdo con la invención se consigue este objetivo mediante el compuesto con las características de la reivindicación 1. Las reivindicaciones subordinadas 2 a 15 aportan configuraciones ventajosas de la invención.

Dentro de un programa científico para el aislamiento de productos naturales biológicamente activos de microorganismos los inventores han aislado y estudiado la bacteria Xenorhabdus bovienii del nematodo Steinernema bibionis.

Mediante cromatografía rápida de reparto centrífuga (FCPC) y HPLC preparativa se aislaron de cultivos de la bacteria Xenorhabdus bovienii los péptidos preferidos de acuerdo con la invención Xenobovida A, B y C.

Xenobovida A Xenobovida B Xenobovida C

Los datos físicos de Xenobovida A, B y C se representan en las tablas 1, 2 y 3 acompañantes, en donde la tabla 1 muestra los datos de RMN (600 MHz, DMSO) de Xenobovida A, la tabla 2 los datos de RMN (600 MHz, DMSO) de Xenobovida B y la tabla 3 los datos de RMN (600 MHz, DMSO) de Xenobovida C.

Las sustancias de acuerdo con la invención presentan en las formas de realización específicas Xenobovida A, B y C la capacidad de inhibir el crecimiento de la bacteria gram positiva Staphylococcus xylosus. Las Xenobovidas B y C presentan además un efecto inhibitorio significativo contra la bacteria gram positiva Bacillus subtilis (ejemplo 3) .

El crecimiento de la bacteria fitopatógena Xanthomonas campestris, entre otros, agente patógeno del ennegrecimiento de la col, se inhibe con Xenobovida A (ejemplo 4) .

Las sustancias de acuerdo con la invención Xenobovidas A, B y C muestran además efectos inhibitorios distintos, significativos contra líneas celulares de tumor, de forma particular contra líneas celulares de tumor de estómago, de tumor de pulmón, de cáncer de mama, de melanoma, de tumor de páncreas, de tumor renal y de tumor intestinal (véase el ejemplo 5) .

La Xenobovida A inhibe la actividad de los siguientes enzimas:

- acetilcolinesterasa (ejemplo 6) : se pueden usar inhibidores de la degradación de acetilcolina en el tratamiento o prevención de enfermedades neurológicas como Myasthenia Gravis o enfermedad de Alzheimer.

- fosfodiesterasa PDE-4B2 (ejemplo 7) : los inhibidores de PDE4 son agentes antiinflamatorios probados, de forma particular en enfermedades pulmonares inflamatorias como asma, bronquitis obstructiva crónica y enfisema pulmonar, así como con rinitis. Estos inhibidores pueden presentar además un efecto antidepresivo y se propusieron también para el uso como psicofármacos. Adicionalmente los inhibidores de PDE4 pueden debilitar la virulencia de VIH y se podrían usar por tanto en la terapia de SIDA.

- proteína tirosina fosfatasa 1B (ejemplo 8) : la proteína tirosina fosfatasa 1B es una diana efectiva para el tratamiento de diabetes y obesidad.

Tanto la Xenobovida A como también la Xenobovida B inhiben además la actividad del glicógeno sintasa quinasa 3beta (ejemplo 9) . La inhibición de este enzima puede jugar un papel en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas agudas o crónicas, así como de diabetes y obesidad, trastornos bipolares, esquizofrenia, alopecia y enfermedades cancerígenas.

Se comprobó el efecto insecticida para Xenobovida A, B y C en larvas de polilla de las colmenas, un parásito en la cría de abejas (ejemplo 10) .

La cría de Xenorhabdus bovienii, así como la purificación de Xenobovidas A, B y C en cultivos de bacteria y la determinación de actividad biológica se describen en los siguientes ejemplos.

1) Producción biotecnológica de Xenobovidas de Xenorhabdus bovienii.

Se asiló X. bovienii según Akhurst y col. (1980, Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol. 121 :303-309) a partir del nematodo Steinernema bibionis. El cultivo se realizó durante 36 horas en un fermentador de 20 l a 20 ºC (Johnigk y col., 2004, Liquid culture mass production of biocontrol nematodes, Heterorhabditis bacteriophora (Nematoda: Rhabditida) : improved timing of dauer juvenile inoculation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 64:651-658) .

2) Aislamiento de Xenobovidas del cultivo de bacterias Se cosechó la solución de cultivo y se agitó con resina de adsorbedor XAD-16N (Amberlite; 10 g/l de solución de cultivo) durante otras 20 horas. Después se lavó la resina con agua (5 ml/g de XAD) y a continuación se eluyó con metanol (2 ml/g de XAD) . Se secó el extracto de XAD metanólico, se resuspendió en agua (300 ml) y se extrajo tres veces con acetato de etilo (300 ml cada vez) . Se secaron las fases de acetato de etilo reunidas y se separó mediante cromatografía de reparto centrífuga rápida (FCPC; Kromaton) . Para ello se usó un sistema de disolvente de dos fases (H2O/MeOH/EtOAc/n-heptano en relación de mezcla 49:51:49:51) , sirviendo la fase superior como fase estacionaria de la cromatografía. La velocidad de giro del FCPC fue de 1380 min-1 y la velocidad de flujo de 6 ml/min. Se purificaron las fracciones que contienen ciclodepsipéptido, que eluían de 24 a 63 minutos, se secaron y se purificaron luego mediante HPLC preparativa:... [Seguir leyendo]

1. Compuesto de estructura general

en la que R es un átomo de hidrógeno (H) y/o un alquilo C1-C20 no sustituido, monosustituido o polisustituido, donde el alquilo está ramificado, es cíclico y/o parcialmente insaturado, o es un resto fenilo no sustituido, monosustituido o sustituido varias veces.

2. Compuesto según la reivindicación 1, caracterizado porque los sustituyentes de R se seleccionan del grupo constituido por un resto alquilo lineal o ramificado, un grupo acilo, un resto halógeno, un grupo amino no sustituido o sustituido con alquilo, un grupo hidroxilo, un grupo éter y un grupo carboxilo libre así como esterificado con grupo alquilo o amidado, donde el grupo acilo es preferiblemente un grupo formilo, acetilo, tricloroacetilo, fumarilo, maleílo, succinilo, benzoílo, o un grupo acilo ramificado o sustituido con heteroátomo o arilo.

3. Compuesto según la reivindicación 1 con la fórmula (Xenobovida A)

incluyendo sus diastereómeros, o con la fórmula

(Xenobovida B)

incluyendo sus diastereómeros o con la fórmula (Xenobovida C) incluyendo sus diastereómeros.

4. Procedimiento para la preparación de un compuesto según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por las etapas:

- cultivo de una bacteria del género Xenorhabdus de una forma conocida .

10. aislamiento del compuesto a partir del medio de cultivo y/o de la bacteria.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la bacteria es Xenorhabdus bovienii.

6. Sustancia según una de las reivindicaciones 1 a 3 para el uso como agente antitumor, preferiblemente para el tratamiento y para la prevención de melanoma, enfermedades de tumor gástrico, tumor de pulmón, cáncer de mama, tumor de páncreas, tumor renal y tumor de intestino.

7. Sustancia según una de las reivindicaciones 1 a 3 para el uso como agente para el tratamiento y la prevención de enfermedades neurológicas, de forma particular Myasthenia Gravis o enfermedad de Alzheimer, o enfermedades neurodegenerativas agudas y crónicas.

8. Sustancia según una de las reivindicaciones 1 a 3 para el uso como agente para la inhibición y la prevención de

la inflamación y, de forma particular en rinitis o enfermedades del pulmón inflamatorias seleccionadas del grupo comprendido por asma, bronquitis obstructiva crónica y enfisema pulmonar.

9. Sustancia según una de las reivindicaciones 1 a 3 para el uso como psicofármaco, de forma particular como antidepresivo o para el tratamiento de trastorno bipolar o de esquizofrenia.

10. Sustancia según una de las reivindicaciones 1 a 3 para el uso en el tratamiento de alopecia o SIDA o como 10 antibiótico.

11. Sustancia según una de las reivindicaciones 1 a 3 para el uso como agente para el tratamiento y la prevención de diabetes o de obesidad.

12. Sustancia según una de las reivindicaciones 1 a 3 para el uso como insecticida.

13. Uso no terapéutico de una sustancia según una de las reivindicaciones 1 a 3 como insecticida. 15 14. Uso de una sustancia según una de las reivindicaciones 1 a 3 como agente fitosanitario.

15. Uso in vitro de una sustancia según una de las reivindicaciones 1 a 3 como inhibidor de acetilcolinesterasa, como inhibidor de fosfodiesterasa, como inhibidor de proteína tirosina fosfatasa o como inhibidor de glicógeno sintasa quinasa 3-beta.