Moléculas de unión para las proteínas similares al factor VIII y factor VIII humano.

polipéptido que se une a un Factor VIII o un fragmento de este que retiene actividad procoagulante del factor VIII,

en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de:

Phe-Gly-Cys-Ser-Trp-Leu-Phe-Pro-Cys-Pro-Phe (sec. con núm. de ident.:5);

Pro-His-Cys-Asn-Trp-Leu-Phe-Pro-Cys-Ser-Leu (sec. con núm. de ident.:6);

Arg-Leu-Cys-Ser-Trp-Ile-Ser-Pro-Cys-Ser-Ala (sec. con núm. de ident.:7);

Phe-His-Cys-Ile-Gly-Val-Trp-Phe-Cys-Leu-His (sec. con núm. de ident.:8); y

Arg-Leu-Cys-Ser-Trp-Val-Ser-Pro-Cys-Ser-Ala (sec. con núm. de ident.:9).

Moléculas de unión para las proteínas similares al factor VIII y factor VIII humano Campo de la invención

La presente invención se relaciona con el campo del aislamiento y purificación de proteínas. Específicamente, la presente invención se refiere a la identificación, aislamiento y síntesis de moléculas de unión que se unen a polipéptidos similares al factor VIII y/o factor VIII. Tales moléculas de unión son útiles para la detección y purificación de polipéptidos similares al factor VIII y factor VIII a partir de soluciones que los contienen.

ANTECEDENTES

La hemofilia clásica A es el resultado de una deficiencia ligada al cromosoma X del factor de coagulación VIII de plasma sanguíneo y afecta casi exclusivamente a varones con una frecuencia de aproximadamente 1 caso por cada 10,000. El defecto del cromosoma X se transmite por los portadores femeninos que no tienen la enfermedad. El Factor VIII también se conoce como factor antihemofílico (AHF), factor hemofílico A, cofactor de plaquetas, tromboplastinogeno, trombocitolisina, y globulina antihemofílica (AHG). La designación 'Tactor VIII: C" se utiliza para indicar que es el compuesto que afecta a la coagulación. Factor VIII es una proteína de alto peso molecular de 280 kDa y se compone de dos cadenas de polipéptido de 200 kDa y 80 kDa, respectivamente. Andersson y otros, Proc. Nati. Acad. Sc¡. U.S.A., 83:2979-2973 (1986). Estas cadenas se mantiene juntas por un puente de ion metálico.

El síntoma principal de la hemofilia A es el sangrado sin formación de coágulos o coagulación. Antes del descubrimiento de que la administración de concentrados de factor VIII pueden aliviar los síntomas de una persona diagnosticada con la enfermedad, la esperanza media de vida de un paciente era de unos 20 años.

Hasta hace pocos años, la principal fuente de factor VIII con fines terapéuticos fue el plasma sanguíneo normal; sin embargo el factor VIII aislado por este método, aunque de alguna utilidad, tiene varias desventajas importantes. Por ejemplo, el factor VIII aislado de plasma sanguíneo es bastante impuro, típicamente tiene una actividad específica de menos de 2 unidades de factor VIII / mg de proteína y un contenido total de factor VIII de menos de 1%. Además, el proceso de purificación es caro porque el material de partida, es decir, plasma humano, es caro. También deben tomarse muchas precauciones para disminuir el riesgo de transmisión de agentes infecciosos al paciente, por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C y otros agentes causantes de enfermedades se detectan comúnmente en la sangre donada. Otra desventaja del uso de factor VIII obtenido por este método es que aproximadamente una décima parte de los pacientes con hemofilia grave desarrollan anticuerpos contra el factor VIII, haciendo la enfermedad difícil de tratar.

Los esfuerzos de investigación se han centrado en el desarrollo de métodos para crear y aislar altamente purificado, factor VIII biológicamente activo de longitud completa y formas derivadas. Las ventajas de una proteína altamente purificada incluyen los niveles de proteínas extrañas reducidos en la mezcla terapéutica, así como una disminución de la probabilidad de la presencia de agentes infecciosos. Una forma más purificada de factor VIII también puede administrarse en dosis más pequeñas, posiblemente reduciendo el riesgo de desarrollar anticuerpos anti-factor VIII, como dosis más bajas serían menos estimulantes para el sistema inmune.

Pasos significativos se han tomado hacia la producción recombinante de factor VIII que comienza con el aislamiento de fragmentos de factor VIII biológicamente activos. Ver, Andersson y otros, patente de los EE.UU. núm. 4,749,780; Andersson y otros, patente de los EE.UU. núm. 4,877,614. El gen que codifica la proteína del factor VIII humano de longitud completa se aisló aprovechando su homología de secuencia con el factor VIII porcino. Ver, Toole y otros, patente de los EE.UU. núm. 4,757,006. Toole y otros, también informan de la expresión de la proteína humana y porcina que tiene actividad factor VIII:C procoagulante.

Sin embargo, todavía existen graves efectos secundarios que implican la producción de anticuerpos anti-factor VIII con la administración de la proteína aislada de ambas fuentes humanas y no humanas. Los anticuerpos que reaccionan con el factor VIILC humano también son conocidos por reaccionar, en cierta medida, con el factor VIILC de otras especies, y el factor VIII porcino en sí es antigénico en seres humanos. Además, los no hemofílicos pueden desarrollar o adquirir la enfermedad, cuando sus sistemas inmunes se sensibilizan al factor VIILC.

Como una posible solución a este problema, ha sido diseñada una proteína truncada, de menor peso molecular que presenta actividad procoagulante. Ver, Toole, patente de los EE.UU. núm. 4,868,112. Toole informó de un método alternativo de tratamiento con el factor VIII porcino de menor peso molecular de aproximadamente 2000 aminoácidos que

muestra actividad procoagulante similar al factor VIII de longitud completa. Evidentemente, la eliminación de ciertos aminoácidos y hasta 19 de los 25 posibles sitios de glicosilación, reduce la antigenicidad de la proteína y por lo tanto la probabilidad de desarrollar anticuerpos anti-factor VIII. Sin embargo, una dificultad con el desarrollo del factor VIII recombinante está alcanzando niveles de producción con rendimientos suficientemente altos.

Recientemente, se han desarrollado moléculas de ADNc de factor VIII suprimido que codifican para derivados de factor VIII recombinantes, que podían dar rendimientos suficientemente altos de una proteína recombinante de factor VIII biológicamente activo para su uso en un proceso industrial para una preparación farmacéutica. Ver, Almstedty otros., U.S. Pat. No. 5,661,008. Almstedty otros, diseñaron un factor VIII modificado derivado de un ADNc de un factor VIII de longitud completa, que, cuando se expresa en células animales, produce altos niveles de una proteína similar al factor VIII con la actividad del factor Vlll. La proteína consistió esencialmente de dos cadenas de polipéptidos derivados del factor VIII humano, las cadenas con pesos moleculares de 90 kDa y 80 kDa, respectivamente. De acuerdo con el proceso de Almstedt y otros, los ADNc de factor Vlll se ensamblan en unidades de transcripción y se introducen en un sistema huésped adecuado para la expresión. Las líneas celulares se pueden cultivar a gran escala en cultivo en suspensión o sobre un soporte sólido. La proteína producida en el medio de cultivo entonces se concentra y se purifica. La proteína activa final se compone de los aminoácidos 1 a 743 y 1638 a través de 2332 de factor Vlll humano Esta secuencia polipeptfdica se conoce comercialmente como rFVIH-SQ o REFACIO®. Véase también, Lind y otros., Euro. J. Biochem., 232:19-27 (1995).Otras formas de FVIH truncado pueden construirse además en las que se elimina generalmente el dominio B. En tales realizaciones, los aminoácidos de la cadena pesada, que consiste esencialmente de los aminoácidos 1 a 740 de Factor Vlll humano y tienen un peso molecular de aproximadamente 90 kD se conectan a los aminoácidos de la cadena ligera, que consiste esencialmente en los aminoácidos 1649 a 2332 del Factor Vlll humano y que tiene un peso molecular de aproximadamente 80 kD. Las cadenas pesadas y ligeras pueden estar conectados por un péptldo enlazador de 2 a 15 aminoácidos, por ejemplo un enlazador que comprende residuos de Usina o arginina, o alternativamente, unidas por un enlace de iones metálicos.

Actualmente, hay una necesidad en el campo de métodos eficientes y rentables para la obtención del factor Vlll activo purificado directamente de varias soluciones, tales como sangre o sobrenadantes de cultivo de células.

La presente invención proporciona nuevos materiales y métodos para identificar, aislar, y purificar el proteínas similares al factor Vlll y factor Vlll, incluyendo REFACTO®, partir de una solución que contiene tales proteínas, en una forma activa. Las moléculas de unión de factor Vlll de la presente Invención exhiben una alta afinidad para el péptidos similares al factor Vlll y factor Vlll. Por tanto la presente Invención proporciona un medio rentable para la purificación rápida de cantidades comerciales de proteínas útiles en el tratamiento de la hemofilia A.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En consecuencia, es un objeto de la presente Invención proporcionar nuevas moléculas de unión para el proteínas similares al factor Vlll y factor Vlll. Las moléculas de unión preferidas de la presente invención exhiben no sólo las características distintivas para la unión... [Seguir leyendo]

1. U polipéptido que se une a un Factor VIII o un fragmento de este que retiene actividad procoagulante del factor VIII, en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de:

Phe-Gly-Cys-Ser-Trp-Leu-Phe-Pro-Cys-Pro-Phe (sec. con núm. de ident.:5);

Pro-His-Cys-Asn-Trp-Leu-Phe-Pro-Cys-Ser-Leu (sec. con núm. de ident.:6);

Arg-Leu-Cys-Ser-Trp-lle-Ser-Pro-Cys-Ser-Ala (sec. con núm. de ident.:7);

Phe-His-Cys-lle-Gly-Val-Trp-Phe-Cys-Leu-His (sec. con núm. de ident.:8); y

Arg-Leu-Cys-Ser-Trp-Val-Ser-Pro-Cys-Ser-Ala (sec. con núm. de ident.:9).

2. Un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1 que se une al factor VIII o un fragmento de este que retiene propiedades procoagulantes del factor VIII, en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de:

AEGTGDFHCIGVWFCLHDPGPEGGGSNHNHz (sec. con núm. de ident.:38);

AEGTGDFGCSWLFPCPFDPGPEGGGS-NHNHz (sec. con núm. de ¡dent.:39); y

Acetil-AEGTGDRLCSWVSPCSADPEGGGSK (sec. con núm. de ident.:43).

3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 que es capaz de unirse al factor VIII humano o un fragmento de este que retiene la actividad procoagulante del factor VIII cuando está en una solución que comprende: 100 mM NH4 OAc, 0.8M NaCI, 1M sorbitol, 0.02% polioxietileno sorbitán monoaleato; 3 mM EDTA, 5 mM CaCI2, pH 6.3 y es capaz d disociarse a partir de dicho factor VIII humano o fragmento de este cuando está en una solución que contiene 50% etilenglicol.

4. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3, que se disocia a partir de dicho factor VIII o fragmento de este cuando se pone en contacto con una solución que comprende 50% de etilenglicol, 20 mM His, 0.25M NaCI, 20 mM CaCI2, 0.01% de polioxietileno sorbitán monoaleato, pH 7.

5. Un método para detectar factor VIII o un fragmento de este que retiene las propiedades procoagulantes del factor VIII en una solución que comprende:

(a) poner en contacto dicha solución con un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y

(b) determinar si ocurre la unión entre dicho polipéptido y dicho factor VIII humano o fragmento de este.

6. Un método para purificar el factor VIII o un fragmento de este que retiene las propiedades procoagulantes del factor VIII que comprende:

(a) inmovilizar un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en un soporte sólido;

(b) poner en contacto una solución que contiene dicho factor VIII humano o fragmento de este con dicho soporte; y,

después de eso,

(c) separar la solución de dicho soporte.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 5 o reivindicación 6, en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de:

Phe-Gly-Cys-Ser-Trp-Leu-Phe-Pro-Cys-Pro-Phe (sec. con núm. de ident.:5);

Pro-His-Cys-Asn-Trp-Leu-Phe-Pro-Cys-Ser-Leu (sec. con núm. de ident.:6);

Arg-Leu-Cys-Ser-Trp-lle-Ser-Pro-Cys-Ser-Ala (sec. con núm. de ident.:7);

Phe-His-Cys-lle-Gly-Val-Trp-Phe-Cys-Leu-His (sec. con núm. de ident.:8); y

Arg-Leu-Cys-Ser-Trp-Val-Ser-Pro-Cys-Ser-Ala (sec. con núm. de ident.:9).

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho polipéptido consiste de una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de:

AEGTGDFHCIGVWFCLHDPGPEGGGS-NHNHz (sec. con núm. de ident.:38);

AEGTGDFGCSWLFPCPFDPGPEGGGS-NHNHz (sec. con núm. de ident.:39); y

Acetil-AEGTGDRLCSWVSPCSADPEGGGSK (sec. con núm. de ident.:43).

9. Un medio de separación que comprende:

(a) un material de matriz cromatográfico, e, inmovilizado en este,

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: Phe-Gly-Cys-Ser-Trp-Leu-Phe-Pro-Cys-Pro-Phe (sec. con núm. de ident.:5); Pro-His-Cys-Asn-Trp-Leu-Phe-Pro-Cys-Ser-Leu (sec. con núm. de ident.:6); Arg-Leu-Cys-Ser-Trp-lle-Ser-Pro-Cys-Ser-Ala (sec. con núm. de ident.:7); Phe-His-Cys-lle-Gly-Val-Trp-Phe-Cys-Leu-His (sec. con núm. de ident.:8); y Arg-Leu-Cys-Ser-Trp-Val-Ser-Pro-Cys-Ser-Ala (sec. con núm. de ident.:9).

10. Un medio de separación que consiste en el producto de reacción de:

(a) un material de matriz cromatográfico reactivo a amina, y

(b) un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de:

AEGTGDFHCIGVWFCLHDPGPEGGGS-NHNHz (sec. con núm. de ident.:38); AEGTGDFGCSWLFPCPFDPGPEGGGS-NHNHz (sec. con núm. de ident.:39); y Acetil-AEGTGDRLCSWVSPCSADPEGGGSK (sec. con núm. de ident.:43).

11. El medio de separación de la reivindicación 10, en donde dicho material de matriz es una resina cromatográfica de metacrilato aldehido-funcional.

12. El medio de separación de la reivindicación 11, en donde dicha resina es un soporte de copolímero de etilenglicol- metacrilato sustituido con formilo.

13. Un método para separar el factor VIII o un fragmento de este a partir de una solución que comprende:

(a) poner en contacto dicha solución con el medio de separación como se define en la reivindicación 9 bajo condiciones de unión,

(b) eliminar el material no unido, y

(c) eluir el factor VIII o fragmento de este unido a partir de dicho medio de separación.

14. Un método para purificar el factor VIII humano o fragmento de este que retiene las propiedades procoagulantes del factor VIII que comprende:

(a) poner en contacto una solución que contiene dicho factor VIII humano o fragmento de este con un soporte sólido que tiene un polipéptido de unión inmovilizado en el soporte, en donde el polipéptido de unión es un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4;

(b) separar la solución de dicho soporte, y

(c) obtener el polipéptido similar al factor VIII y/o factor VIII humano unido a partir del soporte.