Nuevos epítopos de linfocitos T citotóxicos del citomegalovirus humano (HCMV), poliepítopos, composiciones que los comprenden, y usos de diagnóstico y profilácticos y terapéuticos para ellos.

Un péptido aislado que comprende un epítopo de linfocitos T citotóxicos (CTL) de un antígeno pp50 de un citomegalovirus de seres humanos (HCMV),

en el que dicho péptido tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en 9 a 20 aminoácidos contiguos de dicho antígeno pp50, y en el que el epítopo de CTL consiste en la secuencia expuesta en SEC ID NO: 165 (VTEHDTLLY), o un lipopéptido que comprende dicho péptido.

Nuevos epítopos de linfocitos T citotóxicos del citomegalovirus humano (HCMV) , poliepítopos, composiciones que los comprenden, y usos de diagnóstico y profilácticos y terapéuticos para ellos Campo de la invención La presente invención se refiere a epítopos de péptidos aislados y composiciones que los comprenden para uso para provocar respuestas de CTL frente a citomegalovirus (CMV) . En particular, la presente invención se refiere a péptidos aislados que comprenden uno o más epítopos de CTL del citomegalovirus humano (HCMV) , y a composiciones de vacuna que los comprenden, para uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de infección por CMV frente a seres humanos. La presente invención también proporciona métodos para producir linfocitos T aislados capaces de reconocer epítopos del péptido HCMV, y métodos para producir tales linfocitos T. Los epítopos de péptidos aislados y los linfocitos T son particularmente útiles en la monitorización de respuestas inmunitarias en diversos marcos clínicos (por ejemplo transplante) y en el diagnóstico de infección por HCMV.

Antecedentes de la invención 1. Información general

Esta memoria descriptiva contiene información de secuencia de aminoácidos preparada usando Patentin Version 3.1, presentada aquí después del Resumen. Cada secuencia se identifica en el listado de secuencias mediante el indicador numérico <210>, seguido del identificador de la secuencia (por ejemplo <210>1, <210>2, etc.) . La longitud de cada secuencia y el organismo fuente se indican mediante la información proporcionada en los campos de los indicadores numéricos <211> y <213>, respectivamente. Las secuencias citadas en la memoria descriptiva se definen mediante el término “SEC ID NO: ”, seguido del identificador de la secuencia (por ejemplo, SEC ID NO: 1 se refiere a la secuencia designada <400>1) .

Como se usa aquí, la expresión “derivado de” se debe tomar para indicar que un número entero especificado se puede obtener de una fuente particular, sin embargo no necesariamente de forma directa de esa fuente.

Excepto que el contexto lo requiera de otro modo o se señale específicamente lo contrario, los números enteros, etapas, o elementos de la invención citados aquí como números enteros, etapas o elementos singulares engloban claramente tanto las formas singular como plural de los números enteros, etapas o elementos citados.

A lo largo de esta memoria descriptiva, excepto que el contexto lo requiera de otro modo, la palabra “comprender”, o variaciones tales como “que comprende” o “comprendiendo”, se entenderá que implica la inclusión de una etapa o elemento o número entero señalado, o grupo de etapas o elementos o números enteros, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o número entero, o grupo de elementos o números enteros.

La presente invención se lleva a cabo sin experimentación innecesaria usando, excepto que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, virología, tecnología de ADN recombinante, síntesis peptídica en disolución, síntesis peptídica en fase sólida, e inmunología. Tales procedimientos se describen, por ejemplo, en los siguientes textos.

1. Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laborator y Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Segunda edición (1989) , todos los Vols I, II, y III;

2. DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes. I y II (D. N. Glover, ed., 1985) , IRL Press, Oxford, todo el texto;

3. Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed., 1984) IRL Press, Oxford, todo el texto, y particularmente los documentos en él por Gait, p. 1-22; Atkinson et al., p. 35-81; Sproat et al., p. 83-115; y Wu et al., p. 135-151;

4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, todo el texto;

5. Animal Cell Culture: Practical Approach, Tercera edición (John R.W. Masters, ed., 2000) , ISBN 0199637970, todo el texto;

6. Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, todo el texto;

7. Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) ;

8. Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.) , toda la serie;

9. J.F. Ramalho Ortigao, “The Chemistr y of Peptide Synthesis” En: Knowledge database of Access to Virtual Laborator y website (Interactiva, Alemania) ;

10. Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land y Fenichel, R.L. (1976) . Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342

11. Merrifield, R.B. (1963) . J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154.

12. Barany, G. y Merrifield, R.B. (1979) en The Peptides (Gross, E. y Meienhofer, J. eds.) , vol. 2, p. 1-284, Academic Press, New York.

13. Wünsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden en Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Müler, E., ed.) , vol. 15, 4ª ed., Partes 1 y 2, Thieme, Stuttgart.

14. Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg.

15. Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg.

16. Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474.

17. Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications) .

2. Descripción de la técnica relacionada HCMV pertenece a la subfamilia  del grupo del virus del herpes, que son grandes virus de ADN estrictamente específicos de especies hospedantes, que codifican alrededor de 170-200 polipéptidos antigénicamente distintos. HCMV se encuentra universalmente en todas las localizaciones geográficas y grupos socioeconómicos, e infecta entre 50 y 85% de adultos (Alford y Brief, en: Virology, 2ª Edición, Fields et. al. eds, Raven Press, 1990) .

Para la mayoría de las personas sanas que adquieren infección primaria por HCMV después del nacimiento, hay pocos síntomas y ninguna consecuencia de salud a largo plazo. Ocasionalmente, algunos adultos con infección primaria por HCMV presentan síntomas de un síndrome semejante a la mononucleosis, con fiebre prolongada y una hepatitis leve. Una vez infectado con HCMV, el virus permanece dormido estableciendo un depósito de células infectadas latentemente a partir de las cuales se produce la reactivación crónica de bajo grado en el ciclo productivo (lítico) del virus a lo largo de la vida. Aunque los factores que controlan la latencia y reactivación no están completamente comprendidos, la alteración del sistema inmunitario mediado por las células del cuerpo, ya sea por inmunosupresión inducida por fármacos o infección por ciertos patógenos, puede reactivar consistentemente el virus (Zaia y Forman, Infect Dis Clin North Am 9, 879-900, 1995) .

Hay situaciones clínicas en las que la infección por HCMV es una causa significativa de morbimortalidad. Por ejemplo, la infección por HCMV plantea riesgos de salud importantes al feto en el útero, a personas que trabajan con niños, y a individuos que tienen un sistema inmunitario comprometido, tales como, por ejemplo, aquellos infectados con HIV-1 o que han sufrido transplante de órganos (Britt, Trends Microbiol 4, 34-81, 1996; Plotkin, Pediatr Infect Dis J 18, 313-325, 1999) .

Con respecto particular a los riesgos de salud para un feto en el útero, esos riesgos parecen estar casi exclusivamente asociados co mujeres no inmunitarias que se infectan durante el embarazo (Fowler et. al, New Engl J Med 326, 663-667, 1992; Murph et. al., en: Epidemiology of congenital cytomegalovirus infection: maternal risk factors and molecular analysis cytomegalovirus strains. 1998) . Los estudios epidemiológicos han mostrado que 80%90% de bebés no nacidos en desarrollo que adquieren infección por HCMV congénita presentan un patrón variable de secuelas patológicas en los primeros pocos años de vida, que pueden incluir pérdida de audición, alteración de la visión, y retraso mental. Otro 5% a 10% de infantes que están infectados pero sin síntomas en el nacimiento tendrán subsiguientemente grados variables de problemas de audición y mentales o de coordinación. En 1996 solo, se estimaron más de 17.000 casos de secuelas o muerte inducida por HCMV en Europa y en los Estados Unidos de América (Plotkin, Pediatr Infect Dis J 18, 313-325, 1999) .

Adicionalmente, estudios recientes sugieren que individuos seropositivos a HCMV que han sufrido angioplastia coronaria desarrollan restenosis más frecuentemente que los pacientes seronegativos (Field, Antivir Chem Chemother 10, 219-232, 1999) , aunque aún... [Seguir leyendo]

1. Un péptido aislado que comprende un epítopo de linfocitos T citotóxicos (CTL) de un antígeno pp50 de un citomegalovirus de seres humanos (HCMV) , en el que dicho péptido tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en 9 a 20 aminoácidos contiguos de dicho antígeno pp50, y en el que el epítopo de CTL consiste en la secuencia expuesta en SEC ID NO: 165 (VTEHDTLLY) , o un lipopéptido que comprende dicho péptido.

2. El péptido o lipopéptido aislado de la reivindicación 1, en el que dicho péptido o lipopéptido se une a una célula de MHC Clase I que expresa CD8+.

3. El péptido o lipopéptido aislado según la reivindicación 1, en el que el péptido o lipopéptido se une a una célula de MHC Clase I que expresa HLA A1.

4. El péptido o lipopéptido aislado según la reivindicación 3, en el que el péptido o lipopéptido se une a una célula CD8+ que expresa HLA A1.

5. El péptido o lipopéptido aislado según la reivindicación 4, en el que dicho péptido consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 165 (VTEHDTLLY) .

6. Un péptido de poliepítopo aislado que comprende dos o más epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) , en el que uno de dichos epítopos de CTL consiste en una secuencia expuesta en SEC ID NO: 165 (VTEHDTLLY) , y uno o más de dichos epítopos de CTL consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

SEC ID NO: 46 (YSEHPTFTSQY) ; SEC ID NO: 5 (NLVPMVATV) ; SEC ID NO: 101 (VLEETSVML) ; SEC ID NO: 7 (RIFAELEGV) ; SEC ID NO: 254 (IIYTRNHEV) ; SEC ID NO: 135 (IMREFNSYK) ; SEC ID NO: 21 (TTVYPPSSTAK) ; SEC ID NO: 1 (SVLGPISGHVLK) ; SEC ID NO: 116 (AYAQKIFKIL) ; SEC ID NO: 33 (QYDPVAALF) ; SEC ID NO: 2 (FTSOYRIQGKL) ; SEC ID NO: 37 (YVKYVYESF) ; SEC ID NO: 15 (DIYRIFAEL) ; SEC ID NO: 3 (FVFPTKDVALR) ; SEC ID NO: 134 (NVRRSWEEL) ; SEC ID NO: 132 (KARDHLAVL) ; SEC ID NO: 41 (QARLTVSGL) ; SEC ID NO: 8 (TPRVTGGGAM) ; SEC ID NO: 109 (KARAKKDEL) ; SEC ID NO: 113 (QIKVRVDMV) ; SEC ID NO: 112 (ELRRKMMYM) ; SEC ID NO: 42 (RRRHRQDAL) ; SEC ID NO: 162 (ARVYEIKCR) ; SEC ID NO: 66 (CPSQEPMSIYVY) ; SEC ID NO: 4 (FPTKDVAL) ;

SEC ID NO: 55 (IPSINVHHY) ;

SEC ID NO: 260 (FEQPTETPP) ;

SEC ID NO: 189 (YAYIYTTYL) ;

SEC ID NO: 56 (QEFFWDANDIY) ;

SEC ID NO: 170 (YEQHKITSY) ;

SEC ID NO: 51 (QEPMSIYVY) ;

SEC ID NO: 47 (SEHPTFTSQY) ; y

SEC ID NO: 63 (QAIRETVEL) .

7. El péptido de poliepítopo aislado según la reivindicación 6, en el que dicho péptido de poliepítopo se une a células que expresan un alelo de MHC Clase I seleccionado del grupo que consiste en: HLA A1, HLA A2, HLA A3, HLA A11, HLA A23, HLA A24, HLA A26, HLA A29, HLA A30, HLA A68, HLA B7, HLA B8, HLA B27, HLA B35, HLA B41, HLA B44, HLA B57, y HLA B58.

8. El péptido de poliepítopo aislado según la reivindicación 6, en el que un epítopo de dicho péptido de poliepítopo tiene especificidad por el supertipo de HLA.

9. El péptido de poliepítopo aislado según la reivindicación 6, que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO: 309; SEC ID NO: 310; SEC ID NO: 311; SEC ID NO: 312; SEC ID NO: 313; SEC ID NO: 314; SEC ID NO: 315; SEC ID NO: 316; SEC ID NO: 317; y SEC ID NO: 318.

10. Una composición de vacuna profiláctica o terapéutica para provocar una respuesta inmunitaria celular en un sujeto humano frente a HCMV, comprendiendo dicha composición una cantidad eficaz del péptido o lipopéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o del péptido de poliepítopo aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en combinación con un vehículo, excipiente, diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

11. La composición de vacuna profiláctica o terapéutica según la reivindicación 10, en la que el adyuvante comprende un adyuvante saponificado que comprende una saponina o una fracción de saponina.

12. Uso del péptido o lipopéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o del péptido de poliepítopo aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, o de la composición de vacuna profiláctica o terapéutica según la reivindicación 10 u 11, en la preparación de un medicamento para potenciar la inmunidad mediada por células específicas de HCMV de un sujeto humano, o para proporcionar memoria inmunológica en un sujeto no infectado contra una futura infección por HCMV.

13. El uso según la reivindicación 12, en el que el sujeto se selecciona del grupo que consiste en: (i) un sujeto que posee una infección por HCMV latente; (ii) un sujeto que posee una infección por HCMV activa; (iii) un sujeto que está inmunosuprimido; (iv) un sujeto que está inmunocomprometido; (v) un receptor de transplante; y (vi) un sujeto en riesgo de sufrir una complicación que surge de infección por HCMV.

14. El uso según la reivindicación 13, en el que el sujeto es una mujer que tiene capacidad reproductora, o una mujer embarazada, o un receptor de transplante de médula ósea.

15. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que la composición comprende una cantidad del péptido o lipopéptido suficiente para activar un CTL o un precursor de CTL en un sujeto.

16. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que la composición comprende una cantidad del péptido o lipopéptido suficiente para provocar o potenciar la expansión de linfocitos T CD8+, o potenciar la inmunidad mediada por células (CMI) específicas de HCMV en un sujeto.

17. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que la composición es inyectable.

18. Un método para preparar un linfocito T reactivo a HCMV, comprendiendo dicho método poner en contacto ex vivo un linfocito T obtenido previamente de un sujeto humano con una cantidad eficaz del péptido o lipopéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o del péptido de poliepítopo aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, o de la composición de vacuna profiláctica o terapéutica según la reivindicación 10 u 11, suficiente para conferir reactividad con HCMV a dichos linfocitos T.

19. Un método para determinar si un sujeto ha sido previamente infectado o no con HCMV, o el nivel de inmunidad mediada por células específicas de HCMV en un sujeto, comprendiendo dicho método poner en contacto ex vivo un linfocito T obtenido previamente del sujeto con una célula presentadora de antígeno (APC) sensibilizada con el péptido o lipopéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o con el péptido de poliepítopo

aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, o con la composición de vacuna profiláctica o terapéutica según la reivindicación 10 u 11, y determinar la activación de un CTL o un CTL precursor, en el que dicha activación de un CTL o un CTL precursor indica que el sujeto ha sido infectado previamente con HCMV, y en el que el nivel de activación de un CTL o un CTL precursor está correlacionado con el nivel de inmunidad mediada por células específicas de HCMV del sujeto.

20. El método de la reivindicación 19, en el que la activación de un CTL o un CTL precursor se realiza mediante un procedimiento que comprende un ensayo seleccionado del grupo que consiste en: ensayo de tetrámeros de MHC clase 1, ensayo de citotoxicidad, ensayo para determinar la producción de IFN-, ensayo de citocinas, ensayo de liberación de cromo, y ELISPOT.

21. El método según la reivindicación 20, en el que el linfocito T está contenido en una muestra biológica obtenida previamente de un sujeto humano.

22. El método según la reivindicación 21, en el que la muestra biológica obtenida previamente de un sujeto es médula ósea, timo, o una muestra que comprende sangre, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o una capa leuco-plaquetaria.

23. Un método para producir un CTL específico de HCMV, que comprende: (i) poner en contacto un linfocito T ex vivo con el péptido o lipopéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o con el péptido de poliepítopo aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, o con la composición de vacuna profiláctica o terapéutica según la reivindicación 11 ó 12, o una célula presentadora de antígeno (APC) , o una estirpe celular linfoblastoide autóloga (LCL) sensibilizada con dicho péptido o lipopéptido o dicha vacuna; (ii) cultivar el linfocito T; y

(iii) seleccionar linfocitos T que proliferan.

24. El método de la reivindicación 23, en el que la puesta en contacto en (i) es en presencia de una citocina.

25. El método de la reivindicación 24, en el que la citocina es IL-2.

26. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, que comprende estimular ex vivo células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) procedentes de un donante sano seropositivo a HCMV con una estirpe celular linfoblastoide autóloga (LCL) que se ha sensibilizado con el péptido o lipopéptido.