Nuevas cepas mutantes de Pseudomonas fluorescens y variantes de las mismas, métodos para su producción y usos de las mismas en la producción de alginato.

Una cepa mutante de P. fluorescens, que es la cepa Pf201 (NCIMB nº 41137) o un mutante de la misma,

en donde dicha cepa mutante produce al menos 10 g de alginato por litro de medio y es estable durante al menos 60 generaciones.

Nuevas cepas mutantes de Pseudomonas fluorescens y variantes de las mismas, métodos para su producción y usos de las mismas en la producción de alginato.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a nuevas cepas mutantes de Pseudomonas fluorescens y a variantes de las mismas, que son capaces de producir grandes cantidades de alginato. El alginato no solo se produce en grandes cantidades, sino también con un cierto contenido determinado en residuos de manuronato y guluronato, con una posible presencia y determinado nivel de grupos acetilo en el alginato, y un peso molecular deseado del alginato. También se describe un alto rendimiento en mutantes con regulación de la producción de alginato. La invención proporciona además métodos para producir nuevas cepas mutantes de Pseudomonas fluorescens y variantes de las mismas, y el uso de las cepas resultantes en la producción de alginato.

Descripción de la técnica anterior

Se conocen diversos microorganismos que producen alginato, la bacteria más estudiada es la bacteria Pseudomonas aeruginosa. Sin embargo tiene un uso limitado cuando se trata de la producción de alginatos para uso en nutrientes o productos farmacéuticos, ya que se asocia con infecciones primarias y secundarias en mamíferos o seres humanos. Otras especies, que podrían ser fuentes seguras, no suelen producir grandes cantidades de alginatos o alginatos con un peso molecular suficientemente elevado y, por esta razón, no se pueden utilizar.

Se conoce que especies no patógenas de Pseudomonas tales como P. putida, P. mendocina y P. fluorescens producen exopolisacáridos similares a alginatos acetilados, Govan J.R.W. et al., J. of General Microbiology (1981), 125, págs. 217-22. También Conti, E. et al., Microbiology (1994), 14, págs. 1125-1132 describen la producción de alginatos a partir de P. fluorescens y P. putida. Sin embargo, no se conoce ningún productor en exceso de alginato que sea estable entre estas cepas.

El documento de patente de EE.UU. n° 4.49.467 de Kelco Biospecialties Ltd. describe la producción de polisacáridos utilizando nuevas cepas de Pseudomonas mendocina. Las cepas producen buenos rendimientos del polisacárido deseado y son relativamente estables en fermentación continua. Las cepas son producidas exponiendo un cultivo de tipo silvestre de P. mendocina a carbenicilina y mutando los clones mucoides resistentes seleccionados con un agente mutágeno. El más estable y, por tanto, más preferido se ha depositado con el n° NCIB 11687. Se obtuvieron concentraciones elevadas de alginato, aproximadamente 2 g/l, en cultivo continuo con nitrógeno limitado con un medio mínimo de glucosa. Una actividad Nasa de alginato estaba presente en los cultivos y dio como resultado un polímero de bajo peso molecular, de baja viscosidad con reología similar a la del alginato de calidad de impresión. La degradación con la enzima Nasa se corrigió con la adición de una enzima proteolítica en el medio, Hacking A.J., et al., (1983) J. Gen. Microbiol., 129, págs. 3473-348. Después de diez generaciones en cultivo continuo, aparecieron variantes no mucoides, Sengha S. S., et al., (1989) J. Gen. Microbiol., 135, págs. 795-84. página 799, segundo párrafo.

Un mutante negativo para la epimerasa del agente patógeno oportunista P. aeruginosa ha sido descrito por Chitnis et al. (199) J. Bacteriol., 172, págs. 2894-29. P. aeruginosa mucoide FRD1 se mutagenizó químicamente y mutantes que eran incapaces de incorporar residuos de ácido gulurónico (G) en el alginato, se aislaron de forma independiente. Ensayos que empleaban una Nasa de alginato específica de G y análisis de resonancia magnética nuclear 1H mostraron que los residuos G estaban ausentes en los alginatos secretados por esos mutantes. Goldberg y Ohman, 1987, J. Bacteriol., 169, págs. 1593-162, produjeron hasta 1,7 g/l de alginato a partir de FRD1 en matraces de agitación. Como es habitual para los productores espontáneos de alginato, aparecieron con frecuencia revertientes no mucoides (Flynn y Ohman, 1988, J. Bacteriol., 17, págs. 1452-146).

Por tanto, existe todavía una necesidad en el mercado de fuentes adecuadas para una producción de alginato en grandes cantidades que sea fiable. En particular, existe una necesidad de fuentes estables que produzcan grandes cantidades de alginato de alta calidad con una estructura definida y un peso molecular deseado, y especialmente de una fuente para la producción de grandes cantidades de alginato biológicamente activo. Además existe también una necesidad de producción de manuronano puro, que se pueda someter a epimerización in vitro con el fin de obtener alginatos con un contenido predeterminado en residuos de guluronato (G).

Compendio de la invención

La presente invención proporciona nuevas cepas mutantes de P. fluorescens, que son estables y producen grandes cantidades de alginato. Algunas realizaciones de la invención es proporcionar variantes de las mismas, que producen alginatos con una estructura definida con respecto al contenido en residuos de manuronato y guluronato, posible presencia y determinado nivel de grupos O-acetilo y un peso molecular deseado de las moléculas de alginato. También se describen mutantes de alto rendimiento con una producción regulada de alginato, y métodos para su producción. Otros aspectos de la invención son; métodos para producir las nuevas cepas mutantes de P. fluorescens que incluyen variantes de las mismas, y usos de los mutantes resultantes en la producción de alginatos, en particular, la producción de alginatos en termentador a media o gran escala, y más particularmente la producción

de alginatos biológicamente activos, o manuronano puro. Los alginatos resultantes son aplicables en diferentes productos alimenticios e industriales, tales como nutrientes, alimentación de animales, cosméticos y productos farmacéuticos, también pueden constituir un producto intermedio adecuado para realizar modificaciones adicionales mediante C5-epimerasas de manuronano, por ejemplo, las epimerasas del documento de patente de EE.UU. n° 5.939.289.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un cultivo bacteriano biológicamente puro de al menos una cepa mutante de P. fluorescens, en el que dicha cepa produce grandes cantidades de alginato. En un primer aspecto de la invención, dicha cepa produce al menos 1 g de alginato por litro de medio. En realizaciones preferidas, el cultivo bacteriano biológicamente puro de al menos una cepa mutante de P. fluorescens, produce por lo menos 1 g de alginato por 4-55 g de fuente de carbono por litro de medio, más preferentemente por 5-55 g de fuente de carbono por litro de medio, y lo más preferido, el cultivo bacteriano biológicamente puro de al menos una cepa mutante de P. fluorescens produce por lo menos 1 g de alginato por 4 g de fuente de carbono por litro de medio.

La cepa mutante pura de la bacteria P. fluorescens y variantes de la misma, incluidas en la invención, están ejemplificadas por cepas mutantes seleccionadas entre el grupo que consiste en las cepas mutantes Pf21, Pf212, PÍ213, Pf2118, Pf2137, Pf2118alglJA, Pf2118algFA, Pf2118AlgLH23R y Pf21MC. En algunas realizaciones, la invención se refiere a un cultivo bacteriano biológicamente puro de al menos una cepa de P. fluorescens en el que la cepa produce alginato con características de producción de alginato de Pf21 y variantes de la misma que conservan dichas características. Tales "características de producción de alginato" pueden ser una o varias de las siguientes: rendimiento en términos de g de alginato/l de medio (g/l) y g de alginato/g de fuente de carbono (g/g de fuente de carbono), la masa molecular promedio, el grado de acetilación y el contenido en G del alginato producido.

En un segundo aspecto, la presente invención comprende una cepa mutante pura de P. fluorescens en la que dicho mutante es capaz de producir grandes cantidades de un alginato que consiste solamente en residuos de manuronato. Las variantes preferidas se pueden seleccionar a partir del grupo que consiste en las cepas variantes PÍ212, Pf213, Pf2118 y PÍ2137.

En un tercer aspecto, la presente invención comprende una cepa mutante pura de P. fluorescens en la que dicho mutante es capaz de producir grandes cantidades de un alginato que tiene un contenido en residuos de guluronato (G) definido entre y 3%. Tales realizaciones se pueden producir por métodos de la invención intercambiando el gen algG de tipo silvestre con un gen mutante, o alterando el gen algG para codificar una enzima C-5-epimerasa de manuronano con una actividad específica más baja que la de la enzima de tipo silvestre.

En un cuarto aspecto de la invención, la cepa mutante pura de P. fluorescens es capaz de producir... [Seguir leyendo]

1. Una cepa mutante de P. fíuorescens, que es la cepa Pf21 (NCIMB n° 41137) o un mutante de la misma, en donde dicha cepa mutante produce al menos 1 g de alglnato por litro de medio y es estable durante al menos 6 generaciones.

2. La cepa mutante de P. fíuorescens según la reivindicación 1, en la que dicha cepa mutante produce al menos 1 g de alginato por 4-55 g de fuente de carbono por litro de medio.

3. La cepa mutante de P. fíuorescens según la reivindicación 1, en la que dicha cepa mutante produce al menos 1 g de alginato por 5-55 g de fuente de carbono por litro de medio.

4. La cepa mutante de P. fíuorescens según la reivindicación 1, en la que dicha cepa produce al menos 1 g de alginato por 4 g de fuente de carbono por litro de medio.

5. La cepa mutante de P. fíuorescens según la reivindicación 1, en la que dicha cepa mutante se selecciona entre el grupo que consiste en la cepa mutante Pf21 (NCIMB n° 41137), Pf212 (NCIMB n° 41138), PÍ213 (NCIMB n° 41139), Pf2118 (NCIMB n° 4114), PÍ2137 (NCIMB n° 41141), Pf2118alglJA (NCIMB n° 41143), Pf2118algFA (NCIMB n° 41142), Pf2118AlgLH23R (NCIMB n° 41144) y Pf21 MC (NCIMB n° 41145).

6. La cepa mutante de P. fíuorescens según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho mutante es capaz de producir un alginato que consiste solo en residuos de manuronato.

7. La cepa mutante de P. fíuorescens según la reivindicación 5 y 6, en la que dicho mutante se selecciona entre el grupo que consiste en las cepas variantes Pf212 (NCIMB n° 41138), Pf213 (NCIMB n° 41139), Pf2118 (NCIMB n° 4114) y PÍ2137 (NCIMB n° 41141).

8. La cepa mutante de P. fíuorescens según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho

mutante es capaz de producir alginato que tiene un contenido (G) en residuo de guluronato definido entre y 3%.

9. La cepa mutante de P. fíuorescens según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho

mutante es capaz de producir alginato sin, o con un número reducido de grupos O-acetilo.

1. La cepa mutante de P. fíuorescens según las reivindicaciones 5 o 9, en la que dicho mutante se selecciona a partir del grupo que consiste en las cepas mutantes variantes Pf2118alglJA (NCIMB n° 41143), Pf2118algFA (NCIMB n° 41142).

11. La cepa mutante de P. fíuorescens según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho mutante es capaz de producir alginato con un peso molecular de entre 5. y 3.. Dalton.

12. La cepa mutante de P. fíuorescens según la reivindicación 11, en la que dicho mutante se selecciona a

partir del grupo de la cepa mutante variante Pf2118AlgLH23R (NCIMB n° 41144).

13. La cepa mutante de P. fíuorescens según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la cepa mutante comprende adicionalmente un gen mutante seleccionado entre el grupo que consiste en: un gen algG mutante, un gen algl mutante, un gen algJ mutante, un gen algL mutante y un gen algF mutante.

14. La cepa mutante de P. fíuorescens según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la cepa

mutante comprende adicionalmente un gen algG mutante que codifica una enzima epimerasa que tiene actividad epimerasa reducida.

15. La cepa mutante de P. fíuorescens según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la cepa mutante comprende adicionalmente un gen algG mutante que está inactivado.

16. Una cepa mutante de P. fíuorescens según la reivindicación 1, que produce al menos 1 g de alginato por litro de medio, en donde en dicha cepa mutante el operón biosintético de alginato está regulado con un promotor inducible diferente del promotor presente en la naturaleza.

17. La cepa mutante de P. fíuorescens según la reivindicación 16, en la que el promotor inducible es un promotor Pm.

18. La cepa mutante de P. fíuorescens según una de las reivindicaciones 16 o 17, en la que el promotor inducible es un promotor Pm, y comprende adicionalmente el gen efectorxyIS.

19. La cepa mutante de P. fíuorescens según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en la que dicha cepa mutante es Pf21 MC (NCIMB n° 41145).

2. La cepa mutante de P. fíuorescens según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en la que dicha cepa mutante produce alginato tal y como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 6, 8, 9 y 11.

21. La cepa muíante de P. fluorescens según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en la que la cepa muíante comprende adicionalmente un gen mutante tal y como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15.

22. Un cultivo bacteriano biológicamente puro de la cepa mutante de P. fluorescens según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

23. Un método para producir la nueva cepa mutante de P. fluorescens según la reivindicación 1, en el que:

(a) una cepa de tipo silvestre de P. fluorescens se pone en contacto con un agente mutágeno, y

(b) las bacterias tratadas de la etapa (a) se cultivan en presencia de uno o varios antibióticos, y

(c) los mutantes mucoides resistentes a los antibióticos se aíslan mediante selección, y

(d) se determinan las propiedades de producción de alginato de los mutantes mucoides aislados de la etapa (c).

24. El método según la reivindicación 23, en el que el agente mutágeno es nitrosoguanidina.

25. El método según las reivindicaciones 23 o 24, en el que las bacterias tratadas de la etapa (a) se cultivan en presencia de un antibiótico D-lactámico o aminoglucósido.

26. El método según las reivindicaciones 23 o 24, en el que las bacterias tratadas de la etapa (a) se cultivan en presencia de carbenicilina.

27. Un método para la producción de una cepa mutante de P. fluorescens según la reivindicación 16, en el que

(i) el promotor del operón biosintético de alginato de una cepa mutante de P. fluorescens, que es la cepa Pf21 (NCIMB n° 41137) o un mutante de la misma, se intercambia a través de un promotor inducible mediante recombinación homologa, y

(ii) genes efectores opcionales se introducen en la bacteria de (i) mediante recombinación homologa, mutagénesis con transposón o por medio de un plásmido, y

(iii) los mutantes se cultivan y a continuación se aíslan por selección, y

(iv) se determinan las propiedades de producción de alginato de los mutantes aislados de (iii).

28. El método según la reivindicación 27, en el que el promotor inducible es Pm procedente del plásmido Tol de P. putida.

29. Un método para producir una cepa mutante de P. fluorescens según la reivindicación 8, caracterizado por que

a) el gen algG de tipo silvestre, que codifica la C-5 epimerasa se clona en un plásmido o un minitransposón y se somete a mutagénesis mediante mutagénesis química o mediante PCR,

b) se construye un derivado de una cepa productora de alginato de P. fluorescens, que carece del gen algG

(cepa A algG), y

c) la genoteca de algG sometida a mutagénesis de la etapa (a) se transfiere a la cepa A algG de P. fluorescens, y las cepas que contienen el plásmido o el transposón se identifican y se somete a ensayo la producción de alginato y la actividad epimerasa, y

d) las cepas que contienen el plásmido o el transposón que contienen un algG mutante que codifica una epimerasa que proporciona alginato con un contenido en residuos de ácido gulurónico entre y 3%, se identifican por el ensayo en la etapa (c), y

e) el gen mutante algG se clona en un vector de sustitución génica, y

f) el vector de sustitución génica de la etapa (e) se transfiere a continuación a una cepa productora de alginato de P. fluorescens con el fin de sustituir su gen algG con el gen algG mutante, haciéndola capaz de expresar el gen mutante.

3. Un método para producir una cepa mutante de P. fluorescens según la reivindicación 8, caracterizado por que

a) uno o varios aminoácidos, que se identifican por mutagénesis y posterior escrutinio para estudiar si son relevantes para la epimerización, se intercambian, a nivel génico, mediante mutagénesis específica del sitio, con aminoácidos diferentes de los que están presentes tanto en la proteína algG mutante como de

tipo silvestre, y

b) el gen muíante se clona en un vector de sustitución génica y este vector se transfiere a una cepa productora de alginato de P. fluorescens en donde reemplaza al gen algG de tipo silvestre y es capaz de expresarlo.

31. Uso de un cultivo bacteriano biológicamente puro de al menos una cepa muíante de P. fluorescens según

la reivindicación 22, para la producción de alginato.

32. Uso de un cultivo bacteriano biológicamente puro de al menos una cepa mutante de P. fluorescens según la reivindicación 22, para la producción a gran escala de alginato en un termentador.