Métodos y composiciones para la inactivación genética.

Una proteína que comprende un dominio de unión al ADN de proteína de dedos de cinc modificado por ingeniería genética,

en donde el dominio de unión al ADN comprende cuatro hélices de reconocimiento de dedos de cinc tal como sigue a continuación:

F1: RSDNLSV (SEC ID Nº: 10)

F2: QKINLQV (SEC ID Nº: 17)

F3: RSDVLSE (SEC ID Nº: 12)

F4: QRNHRTT (SEC ID Nº: 13).

Métodos y composiciones para la inactivación genética

CAMPO TÉCNICO

La presente descripción pertenece a los campos de ingeniería genómica y de polipéptidos y recombinación homóloga.

ANTECEDENTES

Se han descrito diversos métodos y composiciones para la escisión dirigida de ADN genómico. Tales sucesos de escisión dirigida se pueden usar, por ejemplo, para inducir la mutagénesis dirigida, inducir deleciones dirigidas de secuencias de ADN celular, y facilitar la recombinación dirigida a un locus cromosómico predeterminado. Véanse, por ejemplo, las Publicaciones de Patente de Estados Unidos Nº 20030232410; Nº 20050208489; Nº 20050026157; Nº 20050064474; Nº 20060188987; y la Publicación de Patente Internacional WO 07/014275.

El CCR5, un receptor de quimioquina con 7 dominios transmembrana, es el co-receptor principal para la entrada del VIH-1 en las células T CD4 (Samson et al. (1996) Nature 382:722-725; Deng et al. (1996) Nature 381:661-666; Alkhatib (1996) Science 272:1955-1958) . Desde el descubrimiento de que la deleción Δ32 homocigota del gen CCR5 se asocia a resistencia al VIH-1, el CCR5 se ha estudiado intensivamente como una diana principal para la terapia de VIH. Aunque se ha mostrado que las moléculas pequeñas inducen la interiorización de receptores o bloquean la interacción CCR5-VIH (Fatkenheuer et al. (2005) Nat. Med. 11:1170-1172) , estas estrategias de moléculas pequeñas han dado como resultado el desarrollo de resistencia a través de la selección de mutantes de escape que de forma interesante continúan usando el CCR5 para entrada viral (Kuhmann et al. (2004) J. Virol. 78:2790-2807) . De forma análoga, hasta la fecha las estrategias basadas en anticuerpos intracelulares, ARNi y antisentido, solo han bloqueado parcialmente la expresión de CCR5.

Por lo tanto, aún existe una necesidad de composiciones que supriman completamente el CCR5 para la penetración fenotípica y la resistencia a largo plazo a la infección con VIH.

Feng Y. et al. informan que ribozimas en horquilla son capaces de reducir el mARN de CCR5 celular y la proteína CCR5 de la superficie celular.

Benkirane M. et al. informan que A37 de CCR5 mutante se une al CCR5, reteniendo de este modo al CCR5 en el retículo endoplasmático y dando como resultado una expresión reducida de la superficie celular.

En el estudio de Yang A-G et al. ellos imitan la resistencia natural de los individuos con CCR5 defectuoso mediante el diseño de una estrategia para suprimir fenotípicamente el CCR5.

Arnould S. et al. describen una estrategia en la que derivan cientos de nuevas proteínas a partir de I-Cre1, una endonucleasa de alojamiento de la familia LAGLIDADG.

SUMARIO

La presente invención se define mediante el presente conjunto de reivindicaciones.

En la presente memoria se describen composiciones y métodos para la inactivación parcial o completa de un gen diana. También se describen métodos para preparar y usar estas composiciones (reactivos) , por ejemplo para inactivar un gen en una célula con fines terapéuticos y/o para producir líneas celulares en las que está inactivado un gen diana.

En un aspecto, en la presente memoria se proporcionan nucleasas de dedos de cinc (ZFN) que tienen sitios diana en el gen CCR-5 humano. En algunas realizaciones, la escisión dentro del gen CCR-5 con estas nucleasas da como resultado una disrrupción permanente (por ejemplo, mutación) del gen CCR5. En determinadas realizaciones, el dominio o dominios de dedos de cinc se somete o se someten a ingeniería genética para unirse a un sitio diana corriente arriba de la mutación Δ32 del CCR5 de origen natural. Las proteínas de dedos de cinc pueden incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más dedos de cinc, teniendo cada dedo de cinc una hélice de reconocimiento que se une a un subsitio diana en el gen diana. En determinadas realizaciones, el gen diana es CCR-5 y las proteínas de dedos de cinc comprenden 4 dedos (denominados F1, F2, F3 y F4 y ordenados de F1 a F4 desde el extremo N al extremo C) y comprenden la secuencia de aminoácidos de las regiones de reconocimiento que se muestran en la reivindicación 1.

Por lo tanto, en determinados aspectos, en la presente memoria se proporciona una proteína que comprende un dominio de unión a ADN de proteína de dedos de cinc modificado por ingeniería genética, en el que el dominio de unión a ADN comprende cuatro regiones de reconocimiento de dedos de cinc ordenadas de F1 a F4 desde el extremo N al extremo C, y en la que F1, F2, F3, y F4 comprenden las siguientes secuencias de aminoácidos: F1: RSDNLSV (SEC ID Nº: 10) ; F2: QKINLQV (SEC ID Nº:17) ; F3: RSDVLSE (SEC ID Nº:12) ; y F4: QRNHRTT (SEC ID Nº:13) .

Cualquiera de las proteínas que se describen en la presente memoria puede comprender adicionalmente un dominio de escisión y/o un semidominio de escisión (por ejemplo, un semidominio de escisión FokI de tipo salvaje o modificado

por ingeniería genética) . Por lo tanto, en cualquiera de las ZFN que se describen en la presente memoria, el dominio de nucleasa puede comprender un dominio de nucleasa de tipo salvaje o semidominio de nucleasa (por ejemplo, un semidominio de escisión de FokI) . En otras realizaciones, las ZFN comprenden dominios o semidominios de nucleasa sometidos a ingeniería genética, por ejemplo semidominios de escisión de FokI sometidos a ingeniería genética, que forman heterodímeros forzados. Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Nº 60/808.486, presentada el 25 de mayo de 2006.

En otro aspecto, la descripción proporciona un polinucleótido que codifica cualquiera de las proteínas que se describen en la presente memoria. Cualquiera de los polinucleótidos que se describen en la presente memoria también pueden comprender secuencias (secuencias dadoras o parches) para la inserción dirigida en el gen diana (por ejemplo, CCR-5) .

En otro aspecto más, se proporciona un vector de administración del gen que comprende cualquiera de los polinucleótidos que se describen en la presente memoria. En determinadas realizaciones, el vector es un vector de adenovirus (por ejemplo, un vector Ad5/35) . Por lo tanto, en la presente memoria también se proporcionan vectores de adenovirus (Ad) que comprenden una secuencia que codifica al menos una nucleasa de dedos de cinc (ZFN) y/o una secuencia dadora para la integración dirigida en un gen diana. En determinadas realizaciones, el vector Ad es un vector Ad quimérico, por ejemplo un vector Ad5/35. En realizaciones adicionales, el gen diana es el gen CCR-5 humano. Los vectores que se describen en la presente memoria pueden comprender secuencias dadoras. En determinadas realizaciones, un solo vector comprende secuencias que codifican una o más ZFN y la secuencia o secuencias dadoras. En otras realizaciones, la secuencia o secuencias dadoras están contenidas en un primer vector y las secuencias codifican ZFN están presentes en un segundo vector.

Las secuencias de ZFN de los vectores (por ejemplo, vectores de Ad) que se describen en la presente memoria por lo general codifican una fusión de una proteína de dedos de cinc (ZFP) y un dominio de escisión o un semidominio de escisión (es decir, un dominio de nucleasa) . La porción de proteína de dedos de cinc de la ZFN se somete a ingeniería genética para que se una a un sitio diana en el gen diana. Las proteínas de dedos de cinc pueden incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6

o más dedos de cinc, teniendo cada dedo de cinc una hélice de reconocimiento que se une a un subsitio diana en el gen diana. En determinadas realizaciones, el gen diana es CCR-5 y las proteínas de dedos de cinc comprenden 4 dedos (denominados F1, F2, F3 y F4) y comprenden la secuencia de aminoácidos de las regiones de reconocimiento que se muestran en la Tabla 1.

En cualquiera de los polinucleótidos o proteínas que se describen en la presente memoria, el dominio de escisión puede comprender al menos un dominio de escisión o al menos un semidominio de escisión. En determinadas realizaciones, el dominio de escisión o semidominio de escisión es un dominio de escisión de tipo salvaje (por ejemplo, un semidominio de escisión FokI de tipo salvaje) . En otras realizaciones, el dominio de escisión o semidominio de escisión está modificado por ingeniaría genética.

En otro aspecto más, la descripción proporciona una célula aislada que comprende cualquiera de las proteínas, polinucleótidos y/o vectores que se describen en la presente memoria. En determinadas realizaciones, la célula se selecciona entre el grupo que consiste en una célula madre hematopoyética, una célula T (por ejemplo, célula T CD4+) , un macrófago, una célula dendrítica y una célula que... [Seguir leyendo]

1.Una proteína que comprende un dominio de unión al ADN de proteína de dedos de cinc modificado por ingeniería genética, en donde el dominio de unión al ADN comprende cuatro hélices de reconocimiento de dedos de cinc tal como sigue a continuación:

F1: RSDNLSV (SEC ID Nº: 10) F2: QKINLQV (SEC ID Nº: 17) F3: RSDVLSE (SEC ID Nº: 12) F4: QRNHRTT (SEC ID Nº: 13) 2.Una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un dominio de escisión o

semidominio de escisión.

3.La proteína de la reivindicación 2, en donde el semidominio de escisión es un semidominio de escisión FokI de tipo salvaje o modificado por ingeniería genética. 4.Un polinucleótido que codifica la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 5.Un vector de administración génica que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4. 6.El vector de administración génica de la reivindicación 5, en donde el vector es un vector adenovírico tal como un

vector Ad5/35. 7.Una célula aislada que comprende la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el polinucleótido de

acuerdo con la reivindicación 4 o el vector de administración génica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6. 8.La célula de la reivindicación 7, en donde la célula se selecciona entre el grupo que consiste en una célula madre

hematopoyética, una célula T, macrófagos, una célula dendrítica y una célula que presenta antígenos.

9.La célula de la reivindicación 8, en donde la célula T es una célula CD4+ o la célula se selecciona entre el grupo que consiste en una célula K562, una célula HEK293, una PM-1, una célula THP-1 y una línea celular GHOST. 10.Un método in vitro para inactivar el gen CCR-5 en una célula humana, método que comprende introducir en la

célula una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; un polinucleótido de acuerdo con la

reivindicación 4 o un vector de administración génico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6. 11.El método in vitro de la reivindicación 10, en donde la célula se selecciona entre el grupo que consiste en una célula madre hematopoyética, una célula T tal como una célula CD4+, un macrófago, una célula dendrítica y una célula que presenta antígenos.

12.El método in vitro de la reivindicación 11, en donde la célula T es una célula CD4+ o la célula se selecciona entre el grupo que consiste en una célula K-562, una célula HEK293, una PM-1, una célula THP-1 y una línea celular GHOST. 13.Polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4, que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido comprende

(i) un dominio de unión al ADN de dedos de cinc que se modifica por ingeniería genética para que se una a un sitio diana en un gen CCR5; y

(ii) un dominio de escisión;

para uso como un medicamento para tratar o prevenir la infección con VIH.

14.El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 13 para uso como un medicamento para tratar o prevenir la infección con VIH, en donde el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4 adicionalmente codifica un segundo polipéptido, en donde el segundo polipéptido comprende

(i) un dominio de unión al ADN de dedos de cinc que se modifica por ingeniería genética para que se una a un segundo sitio diana en un gen CCR5; y

(ii) un dominio de escisión.

15.El uso del polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 14 para uso como un medicamento para tratar o prevenir la infección con VIH, en donde el polipéptido comprende un dominio de unión al ADN de proteína de dedos de cinc modificado por ingeniería genética, en el que el dominio de unión al ADN comprende cuatro regiones de reconocimiento de dedos de cinc tal como sigue a continuación:

F1: DRSNLSR (SEC ID Nº: 2) F2: VSSNLTS (SEC ID Nº: 6) F3: RSDNLAR (SEC ID Nº: 4) F4: TSGNLTR (SEC ID Nº: 8) .

salvaje

pb

Célula T

Célula T

Célula TCélula TCélula T

Célula T

Célula T

Célula T

Células T Modificadas

disrrupción

disrrupción DELECIONES:

Células T modificadas

Disrrupción